量子点双光子激发FRET新方法及其生物分析应用

Two-photon excited fluorescence resonance energy transfer (TPE-FRET) can eliminate the autofluorescence of biomolecules and the scattered excitation light. Besides, the IR light causes much less photobleaching off the focal plane and less photodamage to biological samples, indicating the usefulness of TPE-FRET in complicated biological sample matrix. However, FRET performance driven by a two-photon excitation process has been limited by the photophysical properties of organic dyes and fluorescent proteins. Considering the large two-photon action cross-section of quantum dots (QDs), this proposal is proposed to develop TPE-FRET technique with QDs as donor and construct several model assays for tumor markers and viral DNA to demonstrate the merits of TPE-FRET based bioassays. Colloidal core/shell QDs with large two-photon action cross-section, good biological compatibility will be synthesized and conjugated to biomolecules via biotin-streptavidin bridge. The effects of shell structure, shell thickness, as well as size on two-photon absorption of core/shell QDs will be investigated and the applicability of TPE-FRET technique with quantum dot as donor in complicated biological sample matrix will be studied by detecting the two-photon excited fluorescence of QDs. The results of this proposal will contribute to the development of TPE-FRET technique and promote its application in biological systems.

双光子激发-荧光共振能量转移(FRET)技术能够避免生物样品自身荧光和散射光的干扰，减少对生物样品的光损伤，适用于复杂生物样品分析。然而双光子激发FRET的分析性能诸如检测的灵敏度等会受到有机荧光染料和荧光蛋白较小双光子活性截面的限制。本项目以常见的生物大分子：肿瘤标志物、病毒DNA为模型化合物，控制合成双光子活性截面大、生物相容性好的核壳型量子点，利用链霉亲和素-生物素识别等方式实现量子点与生物大分子的可控偶联，通过检测量子点双光子激发荧光信号的变化，深入研究以量子点为供体的双光子激发FRET技术在复杂生物样品分析中的应用，阐明量子点的双光子激发性质与壳层结构、壳层厚度、粒径大小之间的关系，从分子水平上揭示量子点双光子激发FRET技术在生物医学分析中的优越性。本项目利用量子点大的双光子活性截面提高双光子激发FRET在实际生物样品分析中的灵敏度，对拓宽FRET的应用领域具有重要的意义。

本项目围绕着具有较大双光子吸收截面的材料的合成、表面修饰及应用等开展研究工作。主要开展了四方面的研究：.（1）采用微波辅助加热的方法合成出量子产率高、双光子吸收截面大的CdTe/CdS近红外量子点，研究了其双光子活性截面与结构的关系。随着量子点粒径的增大，壳厚逐渐增加，其双光子活性截面呈现先增大后减小的趋势，说明量子点的双光子活性截面与其壳层厚度和粒径大小有关。该工作可为研究量子点的双光子活性截面与结构的关系以及筛选具有较大双光子活性截面的量子点提供参考。.（2）合成了溶酶体定位的双光子比率型硫化氢荧光探针。在单光子和双光子激发模式下，该探针成功地用于溶液中硫化氢的检测。双光子共聚焦显微成像实验表明该探针可成功地对活细胞内正常、过低、过高浓度的硫化氢做出相应响应。该工作可为拓宽双光子激发在生物检测和成像中的应用提供参考。.（3）合成了发射波长为545 nm的CdTe QDs，研究了QDs与硫酸鱼精蛋白间的相互作用。研究发现硫酸鱼精蛋白对QDs的荧光有较强的猝灭作用。通过荧光寿命等实验探讨了猝灭机理。通过等温量热滴定实验探讨了两者之间的作用力。该工作可为研究QDs与等电点较高蛋白质的相互作用提供参考。.（4）合成了蓝光发射的碳点，研究了碳点与荧光素异硫氰酸酯间的相互作用。混合后，由于内滤光作用，随着荧光素异硫氰酸酯浓度的增大，碳点的荧光强度逐渐降低，并显示出pH依赖性。偶联后，荧光寿命实验显示碳点与荧光素异硫氰酸酯之间发生荧光共振能量转移。该工作可为碳点在单光子和双光子生物检测、生物成像等方面的应用提供参考。