基于集成化双酶-量子点纳米探针的化学发光生物分析新方法

The technique based on chemiluminesecence ressonance energy tansfer (CRET) has shown its unique advantages in the bionalysis such as no light source, simplicity of instrument, variety of chemiluminescence reaction system, etc. Combining CRET with quantum dots (QDs), CRET-QDs probes have been deveolped with the potential of good appllication in bionalysis. In this project, the bienyme system, i.e. horseradish peroxidase and oxidase,are going to be introduced into QDs probes for fabrication of a novel integrated bienzyme-QDs nanoprobe and corresponding CRET system. The construction of integrated probe is based on the recognition between antibody and antigen which are labled with horseradish peroxidase and oxidase, respectively. Utilizing the new probe and CRET system, multiplexed analytical methods will be established for direct determination of oxidase substrates and immunoassay of the tumor markers and the metabolisms related to cardiomyopathy. In the fabricated bienzyme-QDs nanoprobe, the coupled enzyme-catalyzed reactions will be conducted at the microarea of QDs surface, thus accopanying high reaction and energy transfer efficiency. In addition,it provides the advantages of elimination of the oxidant,ultralow chemiluminescence background and low reagent consumption. The accomplishment of this project will further improve the application of QDs probe in bioanalysis.

化学发光共振能量转移（CRET）在生命分析中已显示了其特有的优势如无需光源、仪器简单、反应设计多样化等，将其与独特光学性能的量子点结合，研究的化学发光共振能量转移量子点（CRET-QDs）探针在生命分析中具有良好的应用前景及实用价值。本项目旨在将双酶体系即辣根过氧化物酶（HRP）和氧化酶引入到量子点中，利用HRP标记抗体、氧化酶标记抗原通过抗原-抗体特异性识别作用构建新型集成化的双酶-量子点纳米探针及相应的CRET新体系，并在此基础上，研究直接多组分分析方法和免疫多组分分析方法以用于氧化酶底物、心肌疾病相关的代谢物及肿瘤标志物等的快速检测。该集成化的新型双酶-量子点纳米探针可实现在量子点表面微区内偶联的酶促反应，不仅具有高的发光反应效率和共振能量转移效率，而且具有无需加入氧化剂、极低的化学发光背景、低试剂消耗等优点，故可有效地促进量子点探针在生命分析中的应用。

化学发光具有无需光源、仪器简单、反应设计多样化等优点，将其与独特光学性能的量子点结合，研究化学发光共振能量转移-量子点探针在生命分析中具有良好应用前景。本项目研究在以下几方面取得重要进展：（1）将氧化酶和辣根过氧化物酶（HRP）一起耦联于量子点上，建立了集成化双酶-量子点纳米探针。该探针中氧化酶在外层催化相应底物生成H2O2，HRP在内层立即催化H2O2与鲁米诺反应，消耗掉H2O2，大大地减少了H2O2对量子点的荧光猝灭效应，提高了化学发光共振能量转移的效率；（2）采用电化学、可视化等技术对双酶即葡萄糖氧化酶-HRP和尿酸酶-HRP的催化效率进行评判与考察，并建立了H2O2和汞离子的传感技术；（3）采用钴离子催化鲁米诺化学发光体系探索了化学发光-量子点共振能量转移的重要条件及影响因素，建立了高灵敏的对苯酚传感技术；（4）以葡萄糖氧化酶为氧化酶代表，与HRP一起耦联于量子点上，成功制备了双酶-量子点纳米探针，并优化了双酶用量、双酶比例、量子点用量等重要参数，用毛细管电泳及凝胶电泳表征了双酶-量子点的纯度。该双酶-量子点纳米探针的化学发光共振能量转移效率比单HRP-量子点高3倍，是目前报道的化学发光-量子点体系中效率最高的。用其它的氧化酶如胆固醇氧化酶、苄胺氧化酶、尿酸氧化酶等也可方便的构建双酶-量子点纳米探针。利用该集成化双酶-量子点探针实现了人体中重要酶底物葡萄糖、胆固醇、苄胺的高灵敏、多组分成像快速分析。