新型真菌Gloeotinia菌株Snef5的杀线活性及相关基因分析

植物线虫病是我国农业生产上的重要病害，近年来由于缺乏高效低毒的杀线虫剂，这类病害的防治成为植物保护领域中最难控制的一类病害。本世纪初由于几种有效的化学杀线剂陆续被禁用，因此研制环境友好型生物杀线剂成为国际研究的热点。.本研究以新型杀线虫真菌Gloeotinia 的高效菌株Snef5为试材，在明确其致病性和优化发酵条件基础上，运用硫酸铵分级沉淀法、超滤、柱层析、HPLC等物理化学分析技术分离纯化和解析菌株代谢产物中的杀线虫活性物质结构；利用SSH抑制差减杂交和Genomic minning方法分析Snef5基因组中与杀线虫活性相关的基因。获得Snef5的杀线虫活性物质将为植物线虫病害的生物防治提供新的生防资源，对杀线虫活性相关基因的分析将为活性物质相关基因的分子调控开拓新的思路，为进一步研究该菌株杀线虫活性基因簇的克隆、代谢网络解析以及新型生物杀线剂的产业化奠定理论基础。

植物线虫病是我国农业生产上的重要病害，也是最难控制的一类病害，研制环境友好型生物杀线剂成为国际研究的热点。本研究以新型杀线虫真菌Snef5菌株为试材，在明确其生物学特性基础上，运用层析、HPLC和NMR等技术分离纯化和解析代谢产物中杀线虫活性物质；利用SSH抑制差减杂交分析Snef5基因组中与杀线虫活性相关的基因簇。取得如下重要研究结果：1. Snef5的生物学特性及其致病性研究: 本研究以形态学鉴定为基础并结合菌株的ITS、β-tublin及18S rDNA序列，鉴定该Snef5菌株为肉座菌目、虫草菌科、Simplicillium chinense。Snef5菌株发酵液对多种植物线虫和小杆线虫都具有较高的致死作用。发酵液稀释后对大豆和番茄生长没有抑制作用，对麦类无致病性，但是高浓度对黄瓜有一定的抑制，可侵染柞蚕茧蛹。Snef5菌株的适宜碳源为可溶性淀粉，适宜氮源为氯化铵或硫酸铵；pH4~pH9、连续光照与黑暗条件均可正常生长；25℃最适宜生长发育，而菌丝生长的致死温度为58℃10min。 2.Snef5杀线虫活性物质分离纯化与结构解析: Snef5发酵液粗提物理化性质研究显示该活性物质是一种强极性弱酸性水溶性抗生素，耐光照、耐高温、耐酸碱，且耐贮存。利用无水乙醇对发酵液中活性物质进行萃取，并经各种层析技术分离，及HPLC纯化得到3个活性组分，后经光谱和NMR进行结构解析，及薄层层析氨基酸试验，初步判断发酵液中的3个组分可能为带氨基结构的两个五环糖类及1个葡萄糖，具体有待进一步验证与分析。 3.利用SSH分析Snef5的差异表达基因: 采用紫外诱变、硫酸二乙酯及ATMT等3种方法进行诱变育种，筛选毒力稳定的菌株，获得2株强毒菌株UV-17、UV-18和2株弱毒菌株UV-15、T-25。应用抑制消减杂交法SSH构建真菌Snef5弱毒菌株与强毒菌株的cDNA文库。经基因分析比对发现多数候选基因功能未知，仅有10条EST片段具有功能，分别与来源于绿僵菌的糖类化合物代谢途径及长枝木霉菌假设蛋白的同源性高，以及与来源于绿僵菌的博来霉素水解酶具有较高的同源性，此差异片段的功能可能与杀线虫活性基因簇相关。研究获得Snef5的杀线虫活性物质将为植物线虫病害的生物防治提供新的生防资源，对杀线虫活性相关基因的分析将为分子调控开拓新思路，为新型生物农药研发奠定基础。