杀线虫Bt菌株YC-10作用机理研究及cry基因的克隆

随着设施栽培和机耕农业的发展，植物线虫病害发生越来越严重，危害逐年增大。生产上主要利用化学农药进行防治，由于化学农药所带来的环境污染、食品安全等一系列问题，生物防治显得尤其重要。Bt能产生杀线虫毒素蛋白，是一种极具应用前景的生防资源。申请人分离获得1株Bt菌株YC-10，室内毒力及温室盆栽试验表明，该菌株对植物线虫具有极强的生物活性。产生的毒素蛋白24h对南方根结线虫J2的LC50为4.6μg/mL。.本项目拟采用生化技术和蛋白质组学技术分离纯化杀线虫毒素蛋白，分析其结构和理化特性；并克隆毒素蛋白相关基因。利用荧光显微技术、电子显微技术以及生理生化实验研究毒素蛋白对靶标线虫行为、结构以及生理代谢的影响，明确其对植物线虫作用位点和方式，阐明杀虫机理。.通过本研究，在明确该菌株毒素蛋白结构特点、杀线虫作用机制的基础上，可获得具有自主知识产权的杀线虫毒素蛋白资源，为杀线虫生防产品的研制打下基础。

植物线虫病害是严重危害农林业生产的主要病害之一，其危害仅次于真菌性病害。全球每年因植物线虫危害而引起的农作物产量损失超过千亿美元。苏云金芽孢杆菌因其对人畜安全无毒，不污染环境，生产成本低，是目前世界上应用最广泛、最成功的微生物杀虫剂。但具有杀线虫作用的Bt菌株极其杀线虫作用研究不多。本研究对筛选获得的杀线虫苏云金芽孢杆菌YC-10的杀线虫作用活性进行了研究，提取总伴胞晶体蛋白用于室内毒性测定，其对南方根结线虫J2和大豆孢囊线虫J2 的LC50分别为5.86mg/L和4.87mg/L。利用YC-10发酵液及其伴胞晶体蛋白混会物进行防治根结线虫病温室盆栽试验以及大田作物小区试验，试验结果表明其发酵液对番茄或黄瓜根结线虫病防效达60%以上，显示出在线虫病害防治上的巨大应用潜力。对YC-10菌株的发酵条件进行优化，获得了最佳的培养基组分及其发酵条件，为其工业化生产提供科学依据。. 将伴胞晶体蛋白进行分离纯化，获得杀线虫毒素蛋白Cry1Ia及其协同增效蛋白Cry1Ac和Cry2Ab。对Cry1Ia进行了杀虫活性及其作用机理研究，研究结果表明Cry1Ia对南方根结线虫J2 96h LC50为13.6mg/L。将Cry1Ia蛋白利用荧光素Sulfo-NHS进行标记，处理南方根结线虫J2,48h后利用共聚焦显微镜观察，发现线虫体内有荧光标记物的存在，表明Cry1Ia蛋白能进入到线虫体内。利用qRT-PCR技术检测线虫鞘脂糖合成酶基因（BRE3），研究Cry1Ia蛋白对BRE3酶基因表达的影响，结果表明其表达量明显受到毒素蛋白Cry1Ia的影响，与对照组线虫差异显著。利用RNAi技术研究线虫BRE3基因被沉默后，线虫对Cry1Ia的抗性反应，试验结果显示经BRE3-dsRNA处理后线虫对Cry1Ia抗性提高。表明鞘脂糖可能为Cry1Ia的作用靶标。同时，对控制合成杀线虫作用蛋白或协同增效蛋白的基因cry1Ia、cry1Ac以及cry2Ab基因进行了克隆和原核表达，获得了工程菌菌株，工程菌菌株经优化培养，利用IPTG诱导后得到高效表达，获得目的蛋白，为工业化生产打下基础。