膜蛋白SipW调控枯草芽孢杆菌形成固体生物被膜的信号传递途径研究

Biofilm is a prevalent lifestyle in nature and close to the life and production of humans. Bacillus subtilis is an important industrial strain and a good modal stain for biofilm research. The study on the biofilm formation by Bacillus subtilis has achieved great progresses in past years, but how the strains sense that they are on the solid surface and achieve the initial adherence is largely unknown. Our previous work showed that SipW was a protein which can regulate the cells to sense the solid surface and achieve the initial adherence. However SipW is a membrane protein and what is the signal transduction pathway of SipW is unclear. In this study, to reveal the signal transduction pathway of SipW, regulatory protein in the SipW pathway will be identified by transposon mutagenesis technique; the function of regulatory protein will be confirmed by knock out and complementation of their genes; the interaction relationship between SipW and regulatory proteins will be analyzed by bacterial two hybrid system; the interaction regions will be determined by linker scanning mutagenesis method; the interaction relationship between regulatory protein and DNA will be studied using electrophoretic mobility shift assay. These research results will reveal the signal transduction pathway of SipW for regulating solid surface adhered biofilm formation by Bacillus subtilis, and give us theory support for controlling the solid surface adhered biofilm formation.

生物被膜是菌体在自然界中一种常见的生存状态，直接影响着人类的生产和生活。枯草芽孢杆菌是研究生物被膜的模式菌株，同时也是重要的工业菌株。目前对枯草芽孢杆菌形成生物被膜的研究虽然已经取得了很多重要进展，但浮游菌体是如何感知固体表面并起始吸附到固体表面的尚不清楚。我们前期工作首次发现膜蛋白SipW能够调控菌体感知固体表面，但还不了解其调控信号的传递途径。因此本研究将利用转座子突变技术寻找SipW信号传递途径中的调控蛋白；利用同源重组法敲除调控蛋白的编码基因，验证调控蛋白的功能；利用细菌双杂交技术分析SipW与调控蛋白之间，以及各调控蛋白之间的相互作用关系；利用接头分区突变技术分析蛋白之间的互作区域；利用凝胶阻滞技术分析调控蛋白与DNA之间的互作关系；从而揭示SipW调控枯草芽孢杆菌形成固体生物被膜的信号传递途径，为人为控制固体生物被膜的形成奠定理论基础。

在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)中，膜蛋白SipW具有两个独立的功能，除了具有信号肽酶功能外还具有调节功能，可以调节菌体感知固体表面，实现游离菌体对固体表面的起始吸附，并上调生物被膜形成相关基因的表达。本课题主要研究SipW调控固体生物被膜形成的信号传递途径。.本研究首先鉴定了与SipW能够直接互相作用的蛋白质，我们利用细菌双杂交技术分析了SipW与SinI, SinR, AbrB, SlrA, SlrR, KinC, KinD, YwcC, YlzA, YaaB, YlbF, YmcA, SigH, DegU, Spo0A, YmdB 和KinB等17个与生物被膜形成调控相关蛋白之间的互做关系。研究结果表明，膜蛋白SipW能够与另外一个膜蛋白组氨酸激酶KinC直接相互作用。KinC能够通过调控Spo0A，SinI，SinR从而调控epsA-O和yqxM-sipW-tasA两个操纵子的表达。在此基础上，本研究利用接头分区突变技术和氨基酸定点突变技术分析了组氨酸激酶KinC与膜蛋白SipW的互作区域和关键的氨基酸位点。首先我们将sipW基因克隆构建到质粒pBL760上，然后利用转座子体外转座，然后将突变的质粒库转化到sipW缺失突变株中，构建了一个被转座子随机插入的突变体库；然后并对突变株形成液体生物被膜和固体生物被膜的能力进行了定量分析；利用荧光蛋白标记技术标记突变株后，利用共聚焦荧光显微镜观察了固体生物被膜形成能力，利用Western blot技术分析信号肽酶活性；筛选了一批调节功能丢失而信号肽酶活性保持完好的突变株，通过测序分析确定SipW的调节功能域。目前已发现KinC能与SipW的N末端和C末端直接互作，该发现对于人为控制生物被膜的形成具有重要意义。.本项目已正式发表论文6篇，其中SCI论文4篇，申请国家发明专利1项。培养或协助培养硕士研究生3名，较好地完成了原定目标。本课题的研究对于理解枯草芽孢杆菌形成生物被膜的机理具有很好的理论指导意义。