慢病毒转染嵌合体HCN1＋4拼接基因构建生物起搏细胞

慢病毒表达系统因其基因组可以整合于宿主基因组中，长时间、稳定表达外源基因并具有较低的免疫原性，受到广泛关注。我们通过慢病毒转染，获得了持续表达HCN2和HCN4的干细胞，建立了研究克隆离子通道的模型；HCN2和HCN4转染乳鼠心肌细胞均可使自发性搏动频率增加，相关研究已发表SCI论著四篇。但和国外同行的研究一样构建的生物起博效率偏低，这是否与选用的单一亚型基因有关？哺乳动物HCN基因共四种，HCN1～HCN4。HCN1激活最快；HCN4激活最慢；起搏活性高的区域HCN4的表达占优势，但其形成的激活通道最慢。所以我们设想在此基础上以慢病毒为载体将HCN1和HCN4起搏基因组装拼接，取长补短，改变HCN异构型的激活/失活动力学，使产生的起搏电流幅度增强，并观察连接蛋白对细胞间通讯以及生物起博效率的影响，从而构建具有长期有效的嵌合体HCN1＋4生物起搏细胞，为最终应用于临床治疗打下基础。

本课题首先在体外通过细胞培养、免疫组化等方法对骨髓基质干细胞的生物学性状、5-氮胞苷诱导后组织学和形态学方面的变化进行研究，以获得移植细胞的最佳移植条件；另外体外包装携带hHCN4基因的慢病毒，研究转染后细胞生存状态和特性，利用全细胞膜片钳记录起搏电流（If电流），RT-PCR、Western blot方法检测各种基因的表达情况，并观察其随时间的变化规律，在体外能否建立起搏样细胞。.研究结果表明：.1.培养的猪MSCs生长稳定，具有横向分化能力；经5-aza诱导后能向心肌样细胞分化。.2. 成功将全长hHCN4目的基因片段从pCDNA3-hHCN4质粒卸载下来，装载到去内毒素穿梭质粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP 上，并成功建立稳定的hHCN4重组慢病毒，该病毒载体有很高的转染效率，其病毒基因组可以整合于宿主基因组中，在体外已获得至少8个月的阳性表达，8个月后因为细胞污染未进一步观察。解决了生物起搏长期有效性的问题。（已授权国家发明专利）本项目构建的起博通道基因亚型HCN重组慢病毒载体已被国内相关同行广泛应用于生物起搏的相关研究，促进了该领域学术的发展，扩大了我们的学术影响。.3.hHCN4重组慢病毒转染心肌样骨髓基质干细胞获得了稳定过表达HCN4基因的起搏样干细胞。这种基因修饰后的心肌样干细胞有可能成为一种有效的生物起搏种子细胞。以慢病毒为载体将HCN1 和HCN4 起搏基因组装拼接，改变HCN 异构型的激活/失活动力学，使产生的起搏电流幅度增强，成果构建具有长期有效的嵌合体HCN1＋4生物起搏细胞，为最终应用于临床治疗打下基础。.4.慢病毒携带HCN4基因转染心肌样干细胞，其表达的IhHCN4具有天然If电流特点，表现为电压与时间依赖性的超极化内向电流、cAMP直接激活并在胞内起作用、Na+/K+离子混合通透，但其通道结构与Na+、K+离子通道并不相同； Cs+、ZD7288可以阻断IhHCN4，Cs+在细胞外起作用，ZD7288在细胞内起作用。.5.胺碘酮可以抑制IhHCN4，这不仅为过表达起搏通道HCN4基因治疗缓慢性心律失常提供理论基础，同时也为胺碘酮治疗由于起搏电流异常增加所致的快速性心律失常提供实验依据。.本项目研究成果已发表论文10篇，其中SCI收录6篇，授权国家发明专利1项，国际大会发言4次。