海南粗榧悬浮细胞的代谢扰动与其三尖杉酯类碱合成途径分析

Cephalotaxus mannii is an important medicine source plant for producing anti-cancer cephalotaxus alkaloids, and the technology of plant cell suspension is an important technical measure for its sustainable utilization. Primary carbon flux will be diverted to the pathway of cephalotaxus alkaloids biosynthesis and elicitors can induce its synthesis-related enzyme gene expression in Cephalotaxus mannii suspension cultures, so the synergistic effect of glycoregulation and elicitors resulted in disturbing normal metabolism of cell and finally led to flux to biosynthetic pathway of cephalotaxus alkaloids in Cephalotaxus mannii suspension cells. By analyzing the changes of transcriptome between the control cells and co-treated cells by glycoregulation and elicitors, the expression of related enzyme gene in the biosynthetic pathway of cephalotaxus alkaloids and its key regulation site can be clarified. . The research contents of this project: ① screening of elicitors with high effect; ② metabolic disturbance of cell by synergistic action of glycoregulation and elicitation; ③ analysis of cellular transcriptome and metabolic pathway of product based on the conditions of metabolic disturbance. And the study target is disturbing the normal metabolism of cell by studying the best combination of glycoregulation and elicitation which promotes cephalotaxus alkaloids production in Cephalotaxus mannii suspension cells, and then analyzing the difference of transcriptome between disturbed and control cells, finally revealing the metabolism pathway of cephalotaxus alkaloids biosynthesis and its key enzyme. The key scientific issues of the project to be resolved is to clarify the key regulation site of the biosynthetic pathway of cephalotaxus alkaloids and the mechanism of the synergistic effect between glycoregulation and elicitors.

海南粗榧是抗癌药物三尖杉酯类碱的重要药源植物，植物细胞悬浮培养是其可持续利用的重要技术手段。海南粗榧悬浮细胞中，通过糖代谢调节，使C素流向三尖杉酯类碱合成途径，利用诱导子激活其合成途径相关酶基因的表达。通过二者的协同作用，扰动悬浮细胞正常代谢，使之转向三尖杉酯类碱合成。通过研究细胞代谢扰动前后的转录组信息，揭示产物合成途径中相关酶基因的表达情况，确定产物合成途径的关键调控位点。本项目研究内容：① 新型高效诱导子的筛选；② 糖代谢调节与诱导协同下的代谢扰动；③ 代谢扰动环境下的转录组与产物代谢通路分析。研究目标：通过研究海南粗榧悬浮细胞中诱导子与糖代谢调节剂的最佳协同组合，以此来扰动细胞的正常代谢，然后从转录水平分析代谢扰动前后产物合成途径相关基因的表达差异，解析其合成代谢途径与关键酶基因。本项目拟解决的科学问题：确定三尖杉酯类碱合成代谢途径的关键调控位点，以及糖代谢调节与诱导的协同机理。

海南粗榧（Cephalotaxus mannii）是抗癌药物三尖杉酯类碱的重要药源植物，植物细胞悬浮培养是其可持续利用的重要方法。三尖杉酯类碱在海南粗榧悬浮细胞中的合成途径是提高其产量的理论基础，本研究通过转录组学技术，探索三尖杉酯类碱在海南粗榧悬浮细胞中合成代谢途径。本研究分成四部分研究内容，即新型高效诱导子的筛选；糖代谢调节与诱导协同下的代谢扰动；细胞生长过程甲基化及去甲基试剂5-Aza-CdR对其生长与产物合成的影响；代谢扰动环境下的转录组与代谢通路分析。在新型高效诱导子的筛选中，主要研究了β-环糊精与冠菌素对海南粗榧悬浮细胞合成三尖杉酯类碱的影响，结果表明35 mmol/L β-环糊精与10 mg/L冠菌素（COR）对产物合成均有明显促进作用，但冠菌素效果更胜一筹。与一般诱导子茉莉酸甲酯(MJ)相比，COR对细胞抑制作用要小，但对产物合成的促进作用要高出MJ的一倍左右。经过诱导子的优化，本研究得到的三尖杉酯类碱产量在7~10 mg/L左右。糖代谢调节与诱导子协同下的代谢扰动方面表明，抑制糖代谢中的糖酵解途径（EMP），使之流向磷酸戊糖途径（HMP），可以增加产物三尖杉酯类碱的合成。针对植物细胞株在传代过程性能下降的问题，本研究考察了细胞生长过程甲基化变化及去甲基试剂5-Aza-CdR对其生长与产物合成的影响。结果表明15 μmol/L的5-Aza-CdR可显著降低细胞生长期的DNA甲基化水平，但对培养后期甲基化水平无明显影响，因此，可以推测5-Aza-CdR主要作用于细胞的初级代谢。最后分析了代谢扰动环境下的转录组与代谢通路，表明粗榧碱合成主要涉及到如下四个代谢途径：a 碳水化合物代谢途径，关键酶是glucose 6-dehydrogenase，hexokinase与fructokinase；b 氨基酸合成途径，涉及到酪氨酸、亮氨酸与异亮氨酸的合成，关键酶amino acid aminotransferase；c 苯丙氨酸合成途径，关键酶shikimate kinase；d 异喹啉生物碱合成途径，tyrosine aminotransferase是关键酶。这些代谢通路分析的结果为今后采用代谢工程策略，提高三尖杉酯碱合成提供了科学基础。