MiR-503靶向ANGPT2和EFNA2在新生血管性眼病中的作用机制研究

Neovascular ocular fundus disease has become the main blinding disease. Nevertheless, the pathogenesis is not clear and there is no effective treatment. MiRNAs play an important role in vasculogenesis and angiogenesis. We found that miR-503 is up-regulated in young mouse retina and a significantly increase of miR-503 levels is also seen in mouse neovascularization models. MiR-503 inhibits vascular endothelial cell migration and tube formation. The target genes ANGPT2 and EFNA2 were screened by predictive software and protein quantitative analysis. Luciferase reporter assay also confirmed that ANGPT2 and EFNA2 are miR-503 targets. ANGPT2 binds to the tyrosine kinase receptor TIE2 and induces Akt pathway activation; EFNA2 binds to its receptor to regulate vascular endothelial cells through Rac1 and cdc42 activation. Given this, we also confirmed that miR-503 down-regulated p-Akt, Rac1 and cdc42 protein expression. This project will further utilize miR-503 knockout mice to analyze phenotype in vasculogenesis and neovascularization, will analyze the effects of target genes ANGPT2 and EFNA2 in vitro and in vivo, and will provide a more detailed illustration of miR-503 in the regulation mechanism of neovascular ocular fundus disease.

新生血管性眼底病已成为主要的致盲性疾病，但其病因尚不够清楚，且缺乏有效的治疗方法。MiRNA在血管发生和新生血管形成过程中起到重要的作用。我们发现，miR-503在幼鼠视网膜中高表达，并在新生血管小鼠模型中表达量增高；miR-503抑制视网膜血管内皮细胞的迁移和管腔形成功能；通过预测软件以及蛋白定量分析筛选到靶基因ANGPT2和EFNA2，并双荧光素酶报告实验得到验证。ANGPT2与酪氨酸激酶受体TIE2结合，激活Akt信号通路；EFNA2与其受体结合，活化Rac1和cdc42，调节血管内皮细胞功能。鉴于此，我们亦确认miR-503下调p-Akt、Rac1及cdc42蛋白表达。本项目研究，拟利用miR-503敲除鼠进行对血管生成及新生血管形成等表型分析，进一步体内外验证靶基因ANGPT2和EFNA2的功能，阐明miR-503通过靶向ANGPT2和EFNA2在新生血管性眼病中的调控分子机制。

新生血管性眼底病已成为主要的致盲性疾病，但其病因尚不够清楚，且缺乏有效的治疗方法。MiRNA在血管发生和新生血管形成过程中起到重要的作用。我们通过不同发育阶段小鼠视网膜miRNA筛查，发现miR-503在幼鼠视网膜中高表达。同时，发现miR-503在小鼠氧诱导视网膜病变（OIR）模型和激光诱导脉络膜新生血管（CNV）模型中表达量均增高。划痕、穿膜和管腔形成等血管内皮细胞功能实验结果显示，miR-503抑制人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）和人视网膜血管内皮细胞（HRMEC）的迁移和管腔形成能力。通过靶基因预测软件筛选以及定量PCR、蛋白定量检测发现，miR-503抑制血管生成素ANGPT2和肝配蛋白EFNA2的表达。荧光素酶报告基因系统实验证实了miR-503靶向调控新靶基因ANGPT2和EFNA2。本项目研究进一步利用miR-503敲除鼠进行视网膜平铺片并凝集素染色分析，发现敲除鼠视网膜血管分支节点增多和总血管长度增加。共聚焦结果显示敲除鼠视网膜浅表层、中间层和深层都呈现很多异常微小血管。分离敲除鼠脉络膜外植体进行发芽实验发现敲除鼠脉络膜外植体出芽增多。对野生型和敲除鼠进行OIR模型或角膜微囊新生血管（CMA）模型均发现敲除鼠新生血管面积明显增多。定量PCR检测到敲除鼠视网膜中ANGPT2表达量显著升高。成功磁珠分选了原代视网膜血管内皮细胞，发现敲除鼠原代视网膜血管内皮细胞的管腔形成能力较野生型的增加。与野生型原代视网膜血管内皮细胞相比，敲除鼠原代细胞中经转录组测序鉴定到637个差异基因（299个上调基因，338个下调基因）。差异基因的GO功能富集分析结果显示：血管形态发生、趋向性、趋药性、轴突发育、感觉器官形态发生、血管生成和轴突导向为最富集的生物学过程；生长因子结合蛋白和生长因子活性蛋白显著富集；最显著富集的胞内区室是胞外基质。差异基因的KEGG生物通路富集分析显示敲除鼠中Ras信号通路、PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路异常活化，粘着斑、胞外基质-受体相互作用和细胞粘附分子显著富集。通过以上研究结果，我们得出以下结论，miR-503可能通过阻断Ang-2/TIE2和ephrin-A2/EphA2信号通路，调控视网膜血管生长发育以及抑制新生血管形成，并在病理性眼底血管病变中发挥保护作用。