IL-17F在实验性新生血管性眼病中的作用和机制的研究

Cornea and choroid are immunoprivileged site. When it meets with infection,chemical injury,AMD or other inflammatory diseases,Corneal Neovascularization (CrNV) or Choroidal Neovascularization (ChNV) will occur and frequently leads to impaired vision. The physiologic regulation of angiogenesis dependents on the proper temporal and spatial delicate balance of activators and inhibitors present within the vascular microenvironment.In most of the preceding caused CrNV and ChNV,bone marrow derived cells,neutrophils,and macrophages infiltrate the cornea and choroid.They exert complicated roles by utilizing different chemokine receptors and proinflammatory signals in the development of CrNV and ChNV. The IL-17 cytokine family consists of 6 cytokines (IL-17A to IL-17F) and at least 5 receptors (IL-17RA to IL-17RE).And we recently found that IL-17F can inhibit HSCs migration to burned corneas and it may be involved in the process of corneal neovascularization. But the role of IL-17F involved in ocular neovascularization is still unclear.So the aims of this study are:firstly,To construct alkali-induced corneal neovascularization model and construct laser-induced choroidal neovascularization model using IL-17F relative knock out mice and explorer the effects on ocular neovacularization under the condition of lacking genes of IL-17F.To find the mechanism of the effects by detecting mRNA and protein expression of relative chemokines by Realtime-PCR and Western-bloting. To detect leukocytes infiltration into pathologic areas by FCS and secondly,using mouse IL-17F recombinant protein to stimulate vascular endothelial cells on different concentration and detecting the effects on vascular formation, apoptosis, proliferation and migration in vitro,then we will analyse the results from in vivo and in vitro experiments to draw reasonable conclusion about the role of IL-17F involved in ocular neovascular diseases and these study would provide clinical theoretical reference for clinical treatment on ocular neovascular diseases.

IL-17F是新近发现的属于IL-17家族中的一个前炎症因子。在炎症反应、肿瘤免疫应答等病理过程中发挥重要作用。申请者新近研究发现，在实验性角膜新生血管模型中，IL-17F重组蛋白能够抑制骨髓造血干/祖细胞向病变角膜组织的迁移，从而推测其可能参与实验性新生血管性眼病发病的病理过程。因此本研究旨在通过：（1）利用IL-17F基因敲除小鼠，构建角膜和脉络膜新生血管模型。检测其在角膜、脉络膜新生血管的发生发展、相关细胞因子及其受体的表达以及炎症细胞、干/祖细胞迁移等过程中的作用；（2）利用IL-17F分子重组蛋白和中和性抗体体外刺激角膜和脉络膜血管内皮细胞，检测其在血管网形成、细胞迁移、增殖和凋亡等过程中对血管内皮细胞的作用等相关实验，综合分析和明确IL-17F在实验性新生血管性眼病发病过程中的确切作用和具体机制，为临床基于通过干预IL-17F等前炎症因子的途径治疗新生血管性眼病提供理论依据。

研究背景：IL-17F属于IL-17家族中的一个前炎症因子。在炎症反应、肿瘤免疫应答等病理过程中发挥重要作用。申请者研究发现在实验性角膜新生血管（CNV）模型中，IL-17F重组蛋白能够抑制骨髓造血干/祖细胞向病变角膜组织的迁移，从而推测其可能参与实验性新生血管性眼病发病的病理过程。主要研究内容：1. 构建角膜新生血管模型，探讨角膜局部应用小鼠IL-17F重组蛋白以及其他相关干预蛋白的干预对CNV发生的影响以及其具体作用机制；2. 体外实验进一步深入探讨相关蛋白对血管内皮细胞增殖、凋亡、迁移以及血管网形成等的影响以及其具体作用机制，用于验证动物实验。重要结果：IL-17F干预后，CNV的发生明显减少；在IL-17F干预组，角膜组织内VEGF和bFGF的表达明显降低。IL-17干预后，CNV的发生显著增多；IL-17还能促进角膜组织内IL-6和IL-8等炎症因子、MCP-1趋化因子以及p-FAK的表达，促进巨噬细胞等炎症细胞向病灶部位的迁移。CCR3拮抗剂阻断CCR3信号通路后，CNV的发生明显降低。ARF抑制剂能抑制碱烧伤诱导的CNV发生，可能与其下调VEGF的表达以及抑制血管内皮细胞的增生和迁移有关。ZO-1紧密连接蛋白能通过抑制VEGF的表达、减少炎症细胞迁移等作用影响实验性角膜新生血管的形成。IP-10能通过结合CXCR3传导信号，抑制VEGF、bFGF等促血管因子的表达等途径抑制CNV的发生。VE-cadherin能通过影响Nox2、PKC等信号通路抑制细胞的凋亡，从而在CNV发生过程中发挥保护性的作用。关键数据：IL-17干预组与对照组CNV的面积分别为0.77±0.13、0.56±0.10。CCR3拮抗剂干预组与对照组CNV的面积分别为0.77±0.15、0.51±0.03；t=12.91，P=0.00。ZO-1抗体干预组与对照组CNV的数目和面积比分别为：数目：128.64±6.18（个）、面积比：3.85±0.43，数目：65.26±4.08（个）、面积比：3.07±0.10，差异均具有统计学意义P1=0.00；P2=0.00）。科学意义：IL-17F及其相关蛋白在CNV发生过程中发挥抑制性的作用为临床基于以IL-17F以及其他相关蛋白作为干预靶分子的治疗策略治疗角膜新生血管以及其他相关新生血管性眼病等提供有价值的实验依据。