RIP1介导坏死性凋亡在脑出血后继发性脑损伤中的作用及其机制研究

Brain cell death is one of the key factors for the secondary brain damage after intracerebral hemorrhage (ICH). In recent years, more and more evidences show that necroptosis plays an important role in the pathophysiological process of many diseases. However, it is not known whether it plays a role in brain injury after ICH. Our results show that the necroptosis is measured in brain tissues after ICH, and expression level of RIP1, which is the critical initiation protein of necroptosis, was significantly increased. These indicate that RIP1 and necroptosis may play an important role in the progression of secondary brain injury after ICH. So, we perform this research in three aspects: first, electron microscopy and PI staining were used to determine the necroptosis exist in brain tissues after ICH, the second is the use of inhibitors, siRNA, overexpression method, to measure RIP1 and necropoptosis playing a role in brain injury after ICH, and the third is the use of inhibitors and site-mutagenesis, combined with a variety of markers of brain injury, explore the molecular mechanism of RIP1 and necroptosis in brain injury after ICH. The results of this project will provide more comprehensive explaining of the pathophysiological mechanism of secondary brain damage after ICH, and a new target for the clinical drug research and development.

脑细胞死亡是脑出血后继发性脑损伤的关键因素之一。近来研究表明，坏死性凋亡在多种疾病的病理生理进程中发挥重要作用；然而其在脑出血后继发性脑损伤中发挥的作用及机制还不清楚。我们的预实验初步证实，脑出血后脑组织中发生坏死性凋亡，且坏死性凋亡关键蛋白RIP1表达水平明显增加，这提示，RIP1介导的坏死性凋亡在脑出血后继发性脑损伤中可能发挥重要作用。因此，我们拟从三方面开展研究，一是利用电镜和PI染色确定坏死性凋亡在脑出血后脑组织中存在，二是采用抑制剂，siRNA，过表达等方法验证RIP1及坏死性凋亡在脑出血后脑损伤中发挥作用，三是以抑制剂，定点突变等干预，结合多种脑损伤指标，探究RIP1及坏死性凋亡在脑出血后脑组织中发挥作用的分子机制。本项目研究结果将使脑出血后继发性脑损伤的病理生理机制得到更全面阐明，并为治疗脑出血临床药物研发提供新的靶点。

本项目为期三年的研究，我们基本按照项目计划书的年度计划执行研究工作。取得了预期的研究成果，并有相关的学术论文发表（Role for RIP1 in mediating necroptosis in experimental intracerebral hemorrhage model both in vivo and in vitro.　Cell Death Dis. 2041-4889, 2017 Mar 2.），简述如下：.1.通过PI染色和坏死小体形成的免疫共沉淀检测，我们最终明确了坏死性凋亡作为可调节的细胞死亡形式的一种，存在于脑出血后脑组织中。.2.我们的研究项目聚焦于RIP1分子，作为坏死性凋亡信号通路的核心因子之一，探究其介导坏死性凋亡在脑出血后继发性脑损伤中发挥的作用。通过抑制剂干预，基因表达水平干预等方式，结合多种脑损伤指标（神经功能评分，脑水肿，血脑屏障破坏等），最终明确RIP1介导坏死性凋亡在脑出血后继发性脑损伤中发挥重要的促进作用，其参与到脑出血后脑损伤的进行性加重过程中。.3.对于RIP1介导坏死性凋亡在脑出血后继发性脑损伤中发挥重要的促进作用的分子机制进行探索，是本项目的研究重点。基于生物信息学分析和前期的文献查阅，我们重点探究了RIP1的S166位点磷酸化在其介导坏死性凋亡在脑出血后继发性脑损伤中发挥作用的分子机制。通过位点特异性突变过表达载体，结合多种脑损伤指标（神经功能评分，脑水肿，血脑屏障破坏等），并应用相关的体外ICH模型，我们最终证实，RIP1的S166位点磷酸化是其参与脑出血后继发性脑损伤过程的重要分子机制。并且RIP1的激活与炎症因子TNF-α的刺激密切相关，且两者之间可能存在正反馈效应，同时参与到脑出血后脑损伤的进行性加重过程中。.