多重耐药外排泵基因oqxAB的表达调控及遗传环境研究

Resistance to quinolone is being increasingly reported in enterobacteriaceae. The resistance-nodulation-division (RND) family efflux pump gene, oqxAB, conferring resistance to quinolones as well as several other antibiotics, was first described in 2004. We detected an oqxAB-positive rate of 100% in 154 K. pneumoniae clinical strains and the expression of oqxAB is markedly decreased in high-level ciprofloxacin-susceptible K. pneumoniae strains. To clarify the function of surrounding regulators and their acid amino substitutions in the gene expression and quinolone resistance profile, we try to clone different oqxAB-containing DNA fragments into a vector via restriction enzyme double-digestion technique. Then we try to analyze the horizontal transmissibility of oqxAB-harboring plasmids by bioinformatics software and we want to characterize the role of oqxAB in selection of quinolones-resistant mutants based on mutant prevention concentration parameters. The project may help to reveal the quinolones resistant mechanism in enterobacteriaceae and might provide the basis for prevention and control of clinical quinolones-resistant strains.

细菌对喹诺酮类的耐药由多种机制引起，2004年报道oqxAB基因编码外排泵可使细菌对环丙沙星等多药敏感性下降。申请者前期研究发现，临床分离肺炎克雷伯菌株中均存在OqxAB外排泵，而部分菌株仍对环丙沙星高度敏感，实时PCR测定发现敏感株的oqxAB表达水平显著低于耐药株；分析基因周边结构，推测oqxAB基因周边的调控子可能参与其表达调控。本研究①通过酶切克隆、定点突变等方法获得oqxAB基因及其周边调控基因的克隆，利用实时PCR技术，阐明调控基因序列及结构改变对oqxAB基因表达水平及耐药表型的影响,揭示其表达调控机制；②通过质粒携带oqxAB基因遗传环境的生物信息学分析，探索耐药基因的起源和传播；③通过最低防突变浓度测定、耐药突变株基因分析，明确oqxAB基因表达在喹诺酮耐药突变选择中的作用。本课题有助于进一步揭示细菌对喹诺酮类的耐药机制，为临床防控耐药菌株的产生和传播提供理论依据。

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，是临床重要致病菌，可引起多种感染。近年来，肠杆菌科细菌对氟喹诺酮类等抗菌药的耐药性日益严重，给临床抗菌治疗带来巨大挑战。2004年发现的RND家族多重耐药外排泵OqxAB可介导大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌等对喹诺酮类多种临床常用抗菌药和喹乙醇等药物耐药性升高。本课题 1）检测2010年3月~5月临床连续分离大肠埃希菌136株和肺炎克雷伯菌共154株，首次报道肺炎克雷伯菌100%携带oqxAB基因，基因检出率远高于同期其他国家和地区。大肠埃希菌中oqxAB基因同源性极高，首次在大肠埃希菌中发现oqxA和oqxB新亚型，分别命名为oqxA2、oqxB2和oqxB3。2）测定喹诺酮类不同耐药水平的肺炎克雷伯菌中oqxAB的表达水平，并探讨局部调控子和整体调控子对oqxAB表达的调控机制，结果显示oqxAB表达受局部调控子oqxR和rarA调节。受试肺炎克雷伯菌临床株主要为ST 11型（34%）。首次发现呈现为多重耐药的ST 494型肺炎克雷伯菌流行。共发现10株ST 494型菌株（19%），均为喹诺酮类耐药或敏感性下降（环丙沙星MICs 1 ~ 16 mg/L），庆大霉素和头孢他啶耐药；检测其中4株oqxAB外排泵基因表达水平均升高，PCR扩增其质粒介导喹诺酮耐药基因，其中3株同时携带qnrD和aac(6’)-lb-cr基因。3）首次发现69K bp大片段缺失的肺炎克雷伯菌临床株K065，缺失片段包括ramA等63个基因。与GenBank已知全基因序列的9株肺炎克雷伯菌比较，可发现该69K bp大片段缺失为K065特有。临床病史资料、小鼠肺炎模型结果、毒力基因检测均提示该菌株为低致病力菌株。而该菌株携带多种耐药基因，在患者体内定植近2月，可能导致耐药基因播散。首次在肺炎克雷伯菌中发现整体调控基因ramA正调控oqxAB外排泵基因表达，并在介导细菌耐药和致病力方面的也起着重要作用。通过本研究明确oqxAB在介导喹诺酮类耐药中的作用，阐明其主要调控机制，探讨ramA基因在介导细菌耐药等方面的作用，为临床应对日益升高的喹诺酮类耐药性提供理论依据。