核仁素对microRNA的调控及其在心肌保护中的作用

核仁素是具有多生物学功能的RNA结合蛋白，但核仁素是否能调控miRNAs的表达，是一个全新的研究领域。申请者前期工作发现核仁素在心肌缺血预适应中表达上调,并起着重要作用；采用核仁素转基因鼠，通过miRNA芯片发现36个差异表达miRNAs，并在其中7个miRNAs的前体序列中发现完整的核仁素结合元件，推测核仁素可能通过与miRNAs前体结合，调控miRNA的表达，进而起心肌保护作用。本项目拟在上述研究的基础上，采用转基因小鼠、基因转染或RNA干扰技术探讨核仁素的心肌保护作用及其对靶miRNAs表达的影响；采用RNA-EMSA、蛋白质-RNA免疫共沉淀及报告基因探讨核仁素对靶miRNAs的调控机制;采用miRNAs过表达、模拟物及抑制物探讨miRNAs对核仁素心肌保护作用的影响。开展本项目有助于阐释核仁素在心脏中的作用及其机制，为缺血性心肌疾病的防治提供新的思路和实验线索。

心肌缺血及缺血-再灌注损伤导致心肌坏死和凋亡，是启动心肌重构和心力衰竭要原因。.本项目拟采用心肌特异性核仁素过表达小鼠，筛选核仁素调控的miRNAs，在心肌损伤模型中观察核仁素及其调控的miRNAs的心肌保护中的作用，探讨核仁素是否通过调控miRNA的生成在损伤心肌中发挥保护作用，初探核仁素调控miRNAs的可能机制。.实验结果：.(1)成功构建核仁素心肌高表达的转基因小鼠，核仁素高表达在整体动物水平能减轻心肌缺血-再灌注损伤。.（2）通过核仁素转基因小鼠，采用高通量筛选技术发现核仁素影响多种miRNAs的生成，其中miR-21等16种miRNAs表达上调，miR-1等8种miRNAs表达下调。通过qRT-PCR验证部分miRNAs，其中miR-21、miR-320在核仁素转基因小鼠中表达上调，miR-133，miR-378表达下调。.（3）在阿霉素所致心肌损伤中miR-21、核仁素表达均上调。核仁素过表达或miR-21mimic能明显抑制DOX所致的心肌细胞损伤，核仁素表达抑制或miR-21mimic可促进DOX所致的心肌细胞损伤。转染miR-21inhibitor能中和核仁素过表达发挥的保护作用，转染 miR-21 mimics作用相反。BTG2可能是miR-21的靶mRNA。.（4）心肌缺血再灌注损伤可导致miR-21表达均上调。I/R短时间内心肌核仁素表达下调，但是磷酸化核仁素上调。核仁素过表达可抑制H2O2所致的心肌细胞损伤，而核仁素低表达可促进H2O2所致的心肌细胞损伤。而且，转染miR-21 inhibitor可以中和核仁素过表达的保护作用。相反，转染miR-21 mimic作用相反。免疫共沉淀技术发现核仁素不仅能与miR-21等miRNAs结合，也能与Ago2发生相互作用。.（5)在缺血再灌注及阿霉素诱导的心肌损伤中，microRNA-126-5p的表达上升。转染mimic组细胞存活率降低，LDH的释放增加，细胞凋亡率升高，而inhibitor组结果则与之相反。在整体动物水平，microRNA-126-5p低表达可明显抑制心肌I/R损伤。.结论：核仁素能调控多种miRNA的生成。核仁素通过调控miR-21的表达增加而发挥保护作用。核仁素可能通过磷酸化与Ago2相互作用增强上调miR-21的生成。microRNA-126-5p低表达可明