流感病毒以巨胞饮方式进入细胞的诱因及其机制

Influenza A virus (IAV) is an enveloped, segmented negativestrand RNA virus infecting a wide variety of birds and mammals. Influenza A virus enters host cells upon binding of its hemagglutinin glycoprotein to sialylated host cell receptors.Whereas dynamin-dependent, clathrin-mediated endocytosis (CME) is generally considered as the IAV infection pathway,some observations suggest the macropinocytosis act as an alternative entry route. Macropinocytosis is a form of growth factor-induced, actin-dependent endocytic process that leads to internalization of fluid and membrane into large vacuoles. It is associated with considerable cell-wide plasma membrane ruffling induced by the activation of actin and microfilaments connected to the plasma membrane. Studies in recent years show that in certain environments influenza virus can invade cells through macropinocytosis , this progect intends to study the entry mechanism of influenza virus by using macropinocytosis as mode to explore the different conditions which changes the cell invasion pathways , thus to further.reveal the entry mechanism of influenza virus.

流感病毒属于基因组分节段的RNA病毒，可感染多种鸟类及哺乳动物且具有广泛的细胞和组织嗜性。流感病毒感染的基础是病毒吸附并侵入细胞，流感病毒入侵细胞的途径具有多样性，可通过依赖于动力蛋白（dynamin）的内噬途径，还可通过动力蛋白非依赖性的吞噬作用进入细胞。采用何种方式侵入细胞由病毒、外界环境及细胞等多种因素共同决定，在这一过程中胞外信号如何通过膜蛋白向胞内传递至关重要。巨胞饮(macropinocytosis)是内吞的一种形式,指在某些因素刺激下,细胞膜皱褶形成大且不规则的原始内吞小泡,从而从外界非选择性的吞入液相分子或大颗粒的过程。研究表明在某些特定环境中流感病毒可通过巨胞饮方式侵入细胞，本研究拟以流感病毒采用巨胞饮方式入侵细胞过程中信号传递为线索，研究流感病毒以巨胞饮方式入侵的诱因及其作用方式，探索在不同条件下其入侵细胞途径的变化，以期能够进一步揭示流感入侵细胞的机制。

禽流感(Avian Influenza)是由A型流感病毒(Influenza A Virus)引起的禽类的传染病。根据禽流感HA和NA的抗原性不同，分为16个HA亚型和9个NA亚型。根据毒力可以分为高致病性、低致病性。大部分H5和H7亚型的禽流感病毒都属于高致病性，仅有少数属于低致病性。.自1997年高致病性禽流感病毒(HPAI) H5N1亚型爆发以来，H5N1流感病毒造成禽类的大量死亡，同时也感染人类，导致至少有50%的死亡率。如何有效地防治H5N1高致病性禽流感病毒成为研究的重点和热点。.为了启动复制，病毒必须要将他们的基因组运输到宿主细胞内。一些病毒可以直接穿透细胞膜将他们的基因组注射进细胞(例如HIV)，而大部分病毒则通过内吞作用进入细胞。由于细胞存在了多种内吞途径，对于每种病毒使用的具体的内吞途径的机制的确定十分困难。本研究为了确定病毒内吞作用的侵入途径，采用DK/35、rDK/35(Q226L/G228S) (H5N1)、rDK35/HA-A160T（H5N1）作为主要研究用毒株，加入Dynamin蛋白的抑制剂Dynasore，通过间接免疫荧光观察病毒侵入情况。结果表明，在胎牛血清存在的情况下，流感病毒能够采用不依赖于Dynamin的侵入方式。而Dynamin蛋白是网格蛋白和小窝蛋白介导内吞的关键蛋白，即流感病毒能够采用不依赖于网格蛋白和小窝蛋白介导的侵入方式侵入细胞。研究表明，5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)可以对细胞的巨胞饮作用进行抑制。本研究采用EIPA抑制剂后，观察病毒侵入情况，结果表明，巨胞饮在禽流感病毒侵入体外培养的细胞中起到一定作用。.在Dynasore存在的情况下，采用DK/35(H5N1)感染DF1、MDCK，结果证明不同的细胞中，巨胞饮都在病毒侵入时发挥一定作用。采用不同受体结合性病毒感染A549时，巨胞饮作用同样发挥一定作用。研究发现，流感病毒侵入细胞是通过HA和NA蛋白与细胞表面的唾液酸受体结合完成的。本研究将细胞表面的唾液酸受体人为抑制后，观察病毒侵入情况。结果表明，病毒需要通过唾液酸受体结合后，内吞或巨胞饮作用才能发挥作用。.本研究所验证的巨胞饮在流感病毒侵入细胞时可能发挥的作用，为流感病毒的感染机理的研究提供了实验依据，对于后续的流感病毒的防控提供了一定的思路。