微管切割蛋白spastin活性控制的分子机制

Microtubules are a very important cytoskeleton in all the eukaryotic cells. Among the various delicate regulations of microtubule dynamics, microtubule severing is an essential way. The mutations of the gene encoding a microtubule-severing protein spastin are a major cause of the neurodegenerative Hereditary Spastic Paraplegia. Dysfunction of spastin is related also with Alzheimer’s Disease. However, the understanding of the activity control of spastin is rather limited. This project, based on the previous study of the working mechanism of spastin, will focus on the mechanism of spastin activity control. By using various biochemical and biophysical techniques, three main questions regarding the critical events of spastin will be addressed: How is the activity of spastin auto-inhibited? How is the activity of spastin turned on by microtubules binding? How is the microtubule-severing activity of spastin controlled by the ATP hydrolysis step? Furthermore, according to these results, peptide inhibitors of spastin will be designed. These results will deepen the understandings of not only the triggering and controlling of microtubule-severing process by spastin, but also the microtubule severing events and their regulation in cells. In addition, the designing of spastin inhibitors may pave a new way for the treatment of spastin-related neurodegenerative diseases.

微管作为一种重要的细胞骨架，需要被精细地调控，其中微管的切割就是一种重要的调控方式。微管切割蛋白spastin的编码基因发生突变会导致遗传性痉挛截瘫的发生，spastin活性的异常还与老年痴呆等疾病相关。但目前对于spastin活性控制机制还缺乏认识。本项目将基于前期对spastin工作机理的研究基础，综合利用各种生物化学与生物物理技术与方法，研究spastin活性自抑制的结构基础，阐明与微管的相互作用如何开启spastin的活性，并揭示ATP水解活性控制其微管切割活性的机制，以期全面理解spastin从低活性状态到高活性状态，再到发挥切割活性这几个重要环节的活性控制机制；然后还将根据所得结果设计出spastin的多肽抑制剂。这不仅可以促进对spastin切割微管活性的启动与控制过程的理解，加深对微管切割事件及其调控的认识，还能为spastin相关神经退行性疾病的治疗摸索新的方向和方法。

Spastin是一个微管切割蛋白，能利用水解ATP产生的能量把微管从中间切开，从而参与调解细胞内微管的动态平衡。Spastin编码基因的突变与遗传性痉挛截瘫的发生密切相关。在spastin蛋白中，肽链C端的AAA结构域具有水解ATP的活性，也能让spastin蛋白形成六聚体来行使微管切割的功能。AAA结构域的前面是MTBD结构域，它没有确定的空间结构，但富含碱性残基，负责与微管相结合。虽然已经有了这些关于spastin的基本活性和工作机制的认识，但是对于spastin活性的调控过程和机制还所知甚少。..本项目围绕着spastin活性调控这一科学问题展开研究。首先发现spastin的ATP水解活性与蛋白浓度之间呈现出负相关性。对MTBD结构域中碱性残基的全部突变能让蛋白的ATP水解活性显著降低，并与蛋白浓度之间呈现正相关性，而且突变蛋白的水解活性能够在具有正常MTBD结构域的无水解活性突变体的存在下恢复到正常水平。这些结果表明MTBD结构域既能促进spastin蛋白寡聚化，又能对寡聚化后的蛋白活性有抑制作用，这很好地起到了抑制spastin本底活性以降低无效水解的作用。..为了进一步探究MTBD结构域与AAA结构域之间的相互作用位点，本项目还对spastin蛋白进行了化学交联和质谱鉴定。在鉴定到的两个结构域中可能参与相互作用的残基中，我们对MTBD中的四个Lys残基进行了突变，但这并没有对活性造成明显影响，说明这四个位点并不是参与活性调控的关键位点。我们还将对AAA结构域中鉴定到的热点位点进行突变研究，以进一步阐明参与活性调控的结构机制。Spastin切割微管的过程中最关键的构象变化还没被阐明。为此，我们还尝试了构建spastin的共价六聚体，通过在AAA结构域的亚基作用面上突变出一对Cys，把它们氧化形成二硫键，以此形成spastin的共价六聚体。得到的均质六聚体将用于验证spastin六聚体的开环对微管切割活性的重要性。这些研究结果促进了对spastin活性调控过程和机制的理解，也为进一步的深入研究奠定了很好的基础。