作为基因载体的超支化聚氨基酸的合成与性能研究

基因治疗可望从根本上治愈一些传统方法难以治疗的疾病，安全高效的基因载体是成功地施行基因治疗的关键之一。病毒类基因载体虽然效率很高，但安全性难以保证。非病毒类载体有生物安全性好，但其转染效率目前仍然难以满足实际应用的需要。对病毒载体进行人工模拟是解决这一难题的可能途径，而聚氨基酸具有良好的生物相容性、结构与蛋白质类似，是模拟病毒蛋白质壳粒的当然之选。本项目拟通过赖氨酸、精氨酸、组氨酸等碱性天然氨基酸的热聚合合成一系列不同组成、不同分子量的超支化阳离子聚氨基酸。这类聚氨基酸中富含的胍基有利于与基因的结合，且能起到与细胞穿透肽类似的促进复合物进入细胞的作用；组氨酸的咪唑侧基在内涵体的弱酸性环境中能起到质子泵的作用而促进基因复合物从内涵体中逃逸。此外，在活性氨基上能方便地进一步键联上对细胞有靶向性或能促进穿越生物膜的多肽或其它基团。通过这些功能团的共同作用，有望得到性能优异的基因载体。

安全高效的基因载体是基因治疗的关键之一。病毒类基因载体虽然效率很高，但安全性难以保证。非病毒类载体生物安全性好，但其转染效率目前仍然难以满足实际应用的需要。对病毒载体进行人工模拟是解决这一难题的可能途径，而聚氨基酸具有良好的生物相容性，结构与蛋白质类似，是模拟病毒蛋白质壳粒的当然之选。本项目合成了超支化聚赖氨酸P-lys及其胍基化产物P-lys-Gx、赖氨酸-精氨酸超支化共聚物P-lys-argx、以低分子量PEI为核的多臂星型聚鸟氨酸PEI-P(Orn)n 及其胍基化衍生物G-PEI-P(Orn)n 等几个系列具有超支化或类似超支化结构的阳离子聚氨基酸。体外细胞实验结果显示，与超支化聚赖氨酸相比，含有胍基的P-lys-Gx及P-lys-argx 对DNA的结合能力更强，能够与DNA形成较紧密、表面电势较高的复合物粒子，基因转染效率显著提高。用制备型凝胶色谱对超支化赖氨酸-精氨酸共聚物P-lys-arg进行了纯化和分级，得到一系列分子量从720至74000的具有较窄的分子量分布的P-lys-arg超支化共聚物。这些聚合物化学组成相近而分子量各不相同，为考察分子量对性能的影响打下了良好基础。实验结果显示，对于较低分子量的级分P-lys-arg-0.7k、2k和6k，其结合DNA的能力及基因转染效率均随着分子量的增加而迅速增加。当分子量达到一万多以后（P-lys-arg-18k、38k和74k），在较低N/P比时转染效率进一步随分子量的增高而有所增加，而在高N/P比时转染效率不再有显著变化。以低分子量PEI为核的多臂星型聚鸟氨酸PEI-P(Orn)n经过胍基化后，部分鸟氨酸单元转化为精氨酸单元。当胍基化程度较高时，在聚合物中随机形成富含精氨酸单元的寡肽链，其结构与穿膜肽类似，有助于对基因的传递。同时，胍基的电荷比胺基的电荷更分散，胍基化能够降低细胞毒性并提高载体对血清的耐受力。在培养基含有10%血清时，PEI-P(Orn)n系列聚合物和25 KDa PEI相似，转染效率下降了两个数量级，而G-PEI-P(Orn)n转染效率并没有下降，在polymer/DNA (w/w)为20时达到最佳转染效率，转染效率比25 KDa PEI高一个数量级以上，表现出良好的应用前景。