新泛素化修饰因子对Hedgehog信号通路调控机制研究

As one of the most conserved signal transduction pathways, Hh signaling regulates cell proliferation and differentiation during many development processes. Dis-regulation of Hh signaling always leads to birth defects and malignant diseases such as cancer and obesity. Smo protein functions as the signal sensor during Hh signal transduction and is both necessary and sufficient for Hh signal activation. Post-translation modifications on Smo protein play important roles in regulating the Hh signaling. Recently, it has been reported that Smo can be ubiquitinated, but the underlying molecular mechanism is still not clear. More importantly, the ubiquitin ligase and deubiquitinase that functionally regulates Smo ubiquitination are unknown. Utilizing a targeted in vivo RNAi screen in Drosophila, we have identified genes that encode ubiquitin ligase and deubiquitinase that may recognize Smo as their substrate. In this proposal, we will investigate how these two novel genes regulate Smo ubiquitination and Hh signaling activity. Detailed analysis of their genetic and biochemical functions will provide important insights on new regulatory mechanism of Hh signal transduction. It has been shown that Smo protein phosphorylation and membrane relocalization are required for its activation, but whether and how do they work together with Smo ubiquitination is entirely unknown. We will focus on dissecting the relationship among these three events and gain a more integrative view on Smo activity regulation.

Hh信号通路作为最为保守的信号途径之一，控制着发育过程中细胞的增殖与分化。Hh信号通路的异常将会导致包括出生缺陷及癌症、肥胖在内的多种发育异常和恶性疾病。Smo蛋白作为Hh通路的信号转换元件，是激活Hh信号通路的充分必要因子。Smo蛋白质转录后水平的调控是Hh通路传导调节机制中最重要的环节之一。最新的报道发现了Smo蛋白可以被泛素化修饰，但是泛素化对Smo活性调控的分子机制还不明朗。更重要的是，能够功能性的调控Smo泛素化水平的泛素连接酶和去泛素酶仍然未知。在模式生物果蝇中，通过靶向性的体内RNAi筛选，我们发现了可能调控Smo的泛素化水平的泛素连接酶和去泛素酶基因。我们将深入探索这两个新基因对Smo活性及Hh信号传导的调控机制。研究表明磷酸化修饰和细胞膜定位都是激活Smo所必需的，但是它们与泛素化之间是否存在调控关系完全未知，本申请将着重对此进行研究, 以阐释对Smo活性调控的整合机制。

Hh信号通路高度保守，其在动物发育过程中有重要的调控功能。Smo蛋白作为Hh通路的信号转换元件，是激活Hh信号通路的充分必要因子。Smo蛋白质转录后水平的调控是Hh通路传导调节机制中最重要的环节之一，但其调控机制仍未完全明了。在模式生物果蝇中，通过靶向性的体内RNAi筛选，我们发现了可能调控Smo的泛素化水平的泛素连接酶基因SA和去泛素酶基因SD。在本项目的资助下，我们对SA和SD的作用机制进行了较深入的研究，主要获得了以下结果：.1)泛素连接酶SA对Smo及Hh信号转导的调控机制。通过突变体分析、遗传互作分析、蛋白互作及泛素化水平检测等实验，明确了SA识别Smo为底物进行泛素化并促进其降解，验证了SA为Hh信号活性的负调控因子。.2)去泛素化酶SD调节Smo的泛素化及Hh信号通路活性的作用机理。结合使用遗传学及生物化学手段，基本确认SD在发育过程中通过去泛素化Smo蛋白实现对SA的拮抗效应，从而表现为Hh信号通路的正调控因子。.3)Smo活性的综合调控机制。验证了Smo的负调控因子Ptc通过促进其泛素化和降解从而抑制其活性，并初步厘清了Smo蛋白的泛素化状态、磷酸化状态和亚细胞定位之间的关系，为深入理解Smo活性的综合调控机制提供了重要的实验依据。. 这些实验结果揭示了Smo的泛素化水平对其活性的重要影响，鉴定出了调控Smo泛素化水平的主要蛋白因子，基本厘清了Smo蛋白的不同修饰方式之间的关系，为深入理解Smo活性的综合调控机制提供了重要的实验依据，具有较重要的理论基础研究意义。Hh信号通路作为最为保守的信号途径之一，控制着发育过程中细胞的增殖与分化。Hh信号通路，特别是Smo的过度活化已被证明与多种癌症发生相关。因此，我们对于Smo蛋白活性调控机制的研究有助于破译肿瘤致病机理，为疾病治疗和药物研发提供理论依据。. 受实验过程中观察到的果蝇翅发育表型启发，我们同时开展了对果蝇Notch信号通路调控机制的研究，鉴定出了一批全新的调控因子并开展了功能研究，一些相关工作已经总结发表为两篇科学论文。.