牙源性角化囊性瘤中Hedgehog信号通路的组成性激活及阻断性治疗的实验研究

牙源性角化囊性瘤（KCOT）是一种常见的颌骨牙源性病损，其生长具有局部侵袭性，临床上易复发，可导致颌骨的严重破坏。我们的系列研究及既往资料表明：KCOT中存在PTCH1 的失活性突变和/或杂合性缺失，推测其将导致Hedgehog通路的组成性激活（constitutive activation），成为KCOT发生的重要原因。本研究将进一步明确KCOT中Hedgehog信号通路的活化状态；通过RNAi技术进行口腔粘膜上皮细胞PTCH1基因沉默，研究PTCH1基因失活对细胞的增殖以及细胞周期等生命活动的影响；以KCOT体外培养细胞系和小鼠移植瘤为研究对象，应用Hedgehog信号通路的特异性抑制剂cyclopamine阻断通路的活性，观察其对细胞/肿瘤增殖、凋亡及细胞周期等的影响，从而明确阻断Hedgehog信号转导在KCOT治疗中的意义，为阻断Hedgehog通路治疗KCOT提供实验依据。

牙源性角化囊性瘤（keratocystic odontogenic tumor, KCOT）是一种常见的颌骨牙源性病损，具有较高的生长潜能和明显的复发倾向，可单发，也可伴发Gorlin综合征。在既往工作的基础上，本课题组已完成对35例GS相关KCOT及73例散发性KCOT的PTCH1基因突变分析，结果在26例散发KCOT（26/73, 35.61%）和25例GS相关KCOT （28/35, 80%）中发现69处PTCH1突变；在30例GS相关KCOT中检测到2例PTCH2的错义突变；在对30例（10例GS相关性和20例散发性）KCOT患者的SMO基因突变分析，对12例（6例GS相关性和6例散发性）KCOT患者的SUFU基因突变分析中未有突变检出。提示在GS相关和散发性KCOT发病过程中PTCH1突变起到关键作用。针对GS的关键致病基因PTCH1进行一系列的功能分析，证实PTCH1截断性突变蛋白丧失对细胞增殖的抑制，能够显著增强Hh信号通路下游转录因子GLI1的活性。.在体外分离培养KCOT纤维囊壁的成纤维细胞，并观察了其细胞增殖、克隆形成、成骨能力和破骨能力的诱导等特点。与牙龈组织成纤维细胞比较发现KCOT纤维囊壁成纤维细胞的体外增殖活性与成骨分化能力均较弱，但KCOT成纤维细胞与破骨前体细胞的混合培养实验发现KCOT成纤维细胞具有更强的促破骨细胞分化能力，可能与上调COX2和VEGF的表达水平有关。采用高通量RNA转录子测序技术和基因芯片技术，比较和筛查了KCOT成纤维细胞与牙龈成纤维细胞和含牙囊肿成纤维细胞的基因表达差异，发现了在KCOT成纤维细胞中显著上调的基因13个，显著下调的基因8个。初步证实LOXL4在KCOT成纤维细胞中的高表达可能与血管新生有关。.在动物模型方面，与军事医学科学院杨晓课题组合作，初步分析了成牙本质细胞（OC-Cre/Smad4fl/fl）和上皮细胞（K5-Cre/Smad4fl/fl）中特异性敲除Smad4基因的小鼠模型其形成颌骨多发囊肿的表型特点，初步观察了Smad4基因缺失是否引起Hh通路的异常激活。结果显示形成颌骨多发囊肿的OC-Cre/Smad4fl/fl小鼠模型，并没有发生Hh通路的异常激活，初步结果提示环巴胺对囊肿发生的抑制作用不明显。.