天蓝色链霉菌中DNA甲基化依赖型限制系统的发现与表征

链霉菌属细菌除了产生大约4000种以上的抗生素和难以记数的次级代谢产物外，还普遍存在强烈的DNA甲基化依赖型（IV）限制系统，大大限制了链霉菌的基因操作，而它们是什么却几乎未知。模式菌株天蓝色链霉菌至少包含四种IV型限制系统，前期实验和分析暗示：它们同其它细菌中报道的能切割同类型甲基化序列的限制酶差异很大。本研究拟从天蓝色链霉菌入手，通过比较基因组学，高通量文库筛选等技术手段，克隆到天蓝色链霉菌中所有的IV型限制酶基因，体外表达这些限制酶并鉴定它们识别和切割甲基化DNA的位点，期望在识别和切割机制等基础理论方面为IV型限制带来新的认识；另一方面，希望从这些IV限制酶中找到能够与脊椎动物基因组中异常超甲基化m5CpG岛结合的蛋白,它们具有发展成早期预测特定癌症工具的潜力。

在原核生物中，DNA甲基化和限制系统几乎总是相伴而生的，随着噬菌体出现甲基化，羟甲基化，糖羟甲基化 DNA，细菌也发展出了对应IV 型限制系统。 链霉菌能够产生 70%以上的抗生素并广泛存在 DNA 甲基化依赖型的IV限制系统，这些限制系统对链霉菌的分子遗传学和抗生素代谢工程研究造成了困扰，但是它们是什么却一无所知。而在真核生物中，CpG 岛异常的超甲基化是导致多种疾病的因素， 所以，鉴定和发现能够特异性结合到m5CpG 上的蛋白或者酶是非常重要的，它们当中相当一部分是IV型限制酶。. 本研究以模式链霉菌为出发菌株，拟从以下三个方面进行研究：1）克隆天蓝色链霉菌中所有的 DNA 甲基化依赖型的 IV 限制酶基因；2）在大肠杆菌中表达纯化候选限制酶，优化其在体外切割甲基化 DNA 的最佳条件，确定其对应的识别序列和切割位点。3）构建一个将所有限制基因都敲除的多突变菌株，可作为链霉菌异源表达的通用宿主。. 取得了如下结果：1) 对能切割甲基化DNA的ScoMcrA（Sco4631）进行了结晶，解析了其初步结构，发现了一个非典型的结合5mC DNA的结构域，类似于真核细胞中的SRA（SET and Ring-associated domain）,它能够特异性结合5mC。2) 克隆和表征了一个SRA-HNH双结构域的蛋白Sco5333，它能结合全甲基化、半甲基化以及单链甲基化DNA，结合5mC DNA时，没有任何DNA序列特异性，Sco5333区分5-甲基胞嘧啶和正常胞嘧啶的差异可达100倍以上，对5-甲基胞嘧啶的结合力比商业化的MeCP2高2倍。定点突变结果显示Sco5333结合5-甲基胞嘧啶是由SRA结构域决定的，而它对dcm+的大肠杆菌的体内毒性却需要SRA和HNH两个结构域的共同作用。.该项具有以下科学意义：目前SRA-HNH在细菌包括链霉菌中非常普遍，但是它们均注释为未知功能的蛋白，Sco5333可以富集DNA上任何位置的5-甲基胞嘧啶，它比现有的同类商业化蛋白更有应用前景。已发现的Sco4631和Sco5333均具有SRA结构域，也许IV限制性内切酶通过其SRA结构域高效特异结合到5-甲基胞嘧啶上，使得HNH结构域在结合位点附近可以高效持续地切割DNA，从而达到限制外来DNA，而最大限度的降低对自身的毒性的目的。