miR-365通过靶向MKP-1调控结核分枝杆菌感染的机制研究

Published studies have demonstrated that microRNAs are master regulators in the modulation of the infection of Mycobacterium tuberculosis (MTB), which is the obligatory pathogen of tuberculosis. Our previous work demonstrated that the expression of miR-365 in the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) is significantly elevated in TB patients as compared to those in healthy donors. Further, overexpression of miR-365 in A549 lung cancer cells inhibited the transcription of mitogen-activated protein kinase phosphatase 1 (MKP1), which was associated with elevated production of the inflammatory cytokines including tumor necrosis factor α (TNF-α) and interleukin 1 β ( IL-1β). The above results suggested that miR-365 might be important for MTB infection by directly targeting MKP-1. Therefore, this work will systematically decipher the mechanism of the regulation of miR-365 on the expression of MKP-1, and characterize the effect of miR-365-MKP1 interaction on the MTB-induced inflammatory responses by employing both cell infection and mouse aerosol infection model. The results will clarify the regulatory mechanism of miR-365 in pathogenesis of TB and further our understanding on the role of microRNAs in the process of MTB infection, hopefully to find novel approaches for the intervention of TB.

microRNA可通过多种方式参与调节结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染过程。我们前期研究发现miR-365在结核病患者外周血单核细胞中表达特征性上调，且miR-365过表达能抑制丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1（MKP-1）mRNA的表达，进而促进炎症因子TNF-α和IL-1β的表达，提示miR-365可能通过靶向调控MKP-1进而调控MTB感染过程。为此，运用多种分子、细胞生物学方法，本研究将系统研究miR-365调控MKP-1表达的分子机制，并进一步从小鼠感染模型验证该调控作用对MTB诱导的炎症反应及结核菌感染过程的影响。该项目的实施将明确miR-365在抗MTB感染中的调控机制，有助于更好地认识microRNA在结核感染中的作用，为结核病的干预和治疗提供新的理论依据。

本课题基于已有的研究基础，提出miR-365可能通过调控靶位基因MKP-1，调控结核感染诱导炎症反应的假设，计划对miR-365调控靶位基因MKP-1的分子机制进行分析和验证。然而我们在项目实际开展中发现，miR-365对主要的炎症细胞因子TNF-α，IL-1β，IL-8起下调作用，证实了miR-365对于炎症反应的负性调控。但是在不同细胞的mRNA水平和蛋白水平实验中，都无法证实miR-365对MKP-1的调控作用。我们进一步通过生物信息学的方法，综合考虑miR-365对炎性因子存在明显的负性调控作用，大胆假设miR-365的靶位基因之一可能是炎症通路上的重要成员。为了研究miR-365在结核感染中的作用机制，通过仔细地比对和分析，结合实验进一步排查的双重手段，我们把目标重新锁定为MyD88基因。找到miR-365可能调控的新的靶位调控基因后，我们按照研究计划，通过miR-365过表达和抑制表达的模型，在不同的体外细胞模型中，从mRNA水平和蛋白水平证实了miR-365对MyD88的负性调控。为了进一步确认miR-365对MyD88基因的调控序列，构建了新的荧光素酶报告基因检测系统，确定了靶位序列在调控中所起的作用。以上这些实验阐明了miR-365在结核感染中，可以通过靶位调控MyD88基因的表达与功能，负性调控结核诱导的炎症反应。.同时，前期验证miR-365为结核感染中重要的微小RNA的临床队列招募中，我们同时发现结核诱导的细胞因子表达差异可以区分活动性结核患者和潜伏结核感染者；此外我们还评价了结核特异性的抗体反应对活动性结核和潜伏结核的区分能力。