酿酒酵母解旋酶/核酸酶Dna2在减数分裂中的功能研究

Gametogenic disorder caused by aberrant meiosis largely accounts for infertility and birth defects. Though meiosis is considered to be the basis of gametogenesis (sperm and egg), the molecular mechanism has not been revealed yet. Dna2 is highly conserved in eukaryotes, and play key roles in modulating DNA damage repair process and maintaining genome stability. Thus, it has become a promising target for curing cancer. Previously, we found Dna2 defect severely affect meiosis; however, its specific function and mechanism in meiosis are yet known. In this project, we propose to use genetic approaches to construct different mutant strains of Dna2 in the model organism, Saccharomyces cerevisiae. The resulting Dna2 mutant strains will be further characterized using multidisciplinary techniques including chromosome spread, immunofluorescence, DNA one dimension and two dimensions electrophoresis, Southern-blot, pulse field gel electrophoresis, and ChIP-Seq. We aim to illuminate the functions and mechanisms of Dna2 in meiosis especially in the generation and repair of DNA double strand breaks, homologous recombination, and homolog chromosome synapsis. Our research will provide referential significance in improving national reproductive health and preventing birth defects by explicting Dna2’s function in meiosis and revealing the mechanism of meiosis.

减数分裂是真核生物有性生殖的必经环节，是配子(精子和卵子)发生的基础。减数分裂异常导致的配子发生障碍是引发不孕不育及出生缺陷的重要原因。但是，减数分裂的分子机制尚不明晰。Dna2在真核生物中高度保守，是调控DNA损伤修复过程的关键蛋白，参与基因组稳定性的维持，已成为抗癌治疗的潜在靶点。我们发现Dna2缺失会严重影响减数分裂，但它在减数分裂的具体功能和作用机制都不清楚。本项目拟以酿酒酵母为材料，构建Dna2的不同突变体，利用染色体展片和免疫荧光、DNA单向/双向电泳和Southern杂交、脉冲场凝胶电泳及ChIP-Seq等技术，系统的解析Dna2在减数分裂中的功能和作用机制，特别是Dna2对双链断裂的产生和修复、同源重组及同源染色体联会等关键事件的影响。本项目的完成将有助于阐明Dna2在减数分裂中的生物学功能，深入揭示减数分裂的分子机制，进而为改善国民生殖健康和预防出生缺陷提供新的借鉴意义。

本项目以酿酒酵母为研究材料，探究解旋酶/核酸酶Dna2在减数分裂中的功能和作用机制。主要发现和成果如下：.1. Dna2是酿酒酵母完成正常减数分裂所必须的.构建减数分裂特异不表达Dna2的缺失突变体(pCLB2-DNA2, dna2-md),分析发现dna2-md的核分裂进程和产孢效率与野生型相比没有明显的差异，但dna2-md产生的孢子不能存活，染色体错误分离率明显升高，表明Dna2是完成正常减数分裂所必需的。.2. Dna2主要在第一次减数分裂的粗线期发挥功能.在第一次减数分裂粗线期之前诱导Dna2降解，产生的孢子无法正常存活;同样的, 在第一次减数分裂粗线期之后诱导Dna2表达，产生的孢子同样无法正常存活。该结果表明，Dna2在减数分裂的作用时间主要集中在第一次减数分裂的粗线期。.3. Dna2缺失导致细胞内通过两种途径累积大量的RPA.染色体展片和免疫荧光实验显示，Dna2缺失会导致RPA在染色体上大量富集，在整个减数分裂进程中持续结合在染色体上；在Dna2缺失突变体中引入Spo11的点突变体(Spo11Y135F),研究发现在没有产生程序性DNA双链断裂的情况下缺失Dna2细胞内仍然会明显累积RPA。上述结果表明，Dna2缺失会导致减数分裂细胞通过DNA双链断裂依赖和不依赖的途径累积大量的RPA。.4. 累积的RPA在DNA双链断裂附近大量累积.RPA的ChIP-seq数据显示，累积的RPA在DNA双链断裂两侧大量富集，进一步表明Dna2缺失导致的RPA累积有一部分来自于程序性DNA双链断裂。.5. Dna2缺失导致程序性DNA双链断裂修复存在明显缺陷.Dna2缺失导致RPA在染色体上持续累积，但研究结果显示Dna2缺失突变体中累积的RPA没有影响DNA双链断裂的产生和重组产物交叉重组(crossover)和非交叉重组(non-crossover)的含量，但最后产生的孢子无法正常存活。脉冲场凝胶电泳显示，Dna2缺失导致减数分裂DNA双链断裂修复不能完成，修复存在明显缺陷，断裂片段持续存在。.6. Dna2是负责切割DNA修复偶联的DNA合成途径中产生RPA的唯一核酸酶.粗线期诱导Dna2表达能够有效去除累积的RPA，使得减数分裂正常完成，产生的孢子存活率明显升高，表明Dna2是唯一能够切割DNA修复偶联的DNA合成途径中产生RPA的核酸酶。