酿酒酵母DNA复制中未激活解旋酶的去除机理及其在DNA复制终止中的功能

MCM2-7 complex is the core part of eukaryotic DNA replicative helicase. Far more MCM2-7 complexes are loaded onto double-stranded DNA in G1 phase than will be utilized in S phase, and only a small amount of latent MCM2-7 can be activated to form functional helicase. To avoid over-replication, the excess inactive MCM2-7 complexes must be removed from chromatin during DNA replication. Currently, it is still unknown how the inactive MCM2-7 complexes are dislodged from DNA. In order to determine the mechanism of displacing latent MCM2-7 from chromatin, we will utilize the budding yeast nuclear extracts which support the DNA replication under physiological condition, combined with the single-molecule techniques, to observe the process of removal in real-time. Meanwhile, we hypothesize that the inactive MCM2-7 complexes might be involved in the DNA replication termination. We will devise single-molecule approaches to dynamically visualize the DNA replication termination, so as to examine potential mechanisms of termination. This project will answer the fundamental open questions in the field of DNA replication. The conclusions from this project would be theoretical breakthroughs and possibly benefit the cancer therapy.

MCM2-7蛋白复合体是真核生物DNA复制解旋酶的核心组成部分。在复制起始的G1期，大量的MCM2-7被装载于双链DNA上，但是只有很少一部分MCM2-7在DNA复制的S期被激活形成有解旋活性的DNA复制解旋酶。过量的未被激活的MCM2-7需要从DNA上去除，以避免它们被误激活而引起DNA复制紊乱。这一去除的过程和机理目前还不清楚。我们将利用酿酒酵母制备可以完全模拟生理条件下DNA复制的体外复制体系，结合单分子成像技术，对MCM2-7的去除过程进行实时的观测，以期阐明去除的机理。根据现有的证据推测，未激活的MCM2-7可能参与DNA复制终止，因此我们也将利用单分子技术对真核生物DNA复制终止的过程进行系统的研究，以证明推测是否正确，进而解析复制终止的机制。本研究将回答真核生物DNA复制领域的基本问题，实现理论上的突破，并可为癌症等疾病的治疗提供理论依据。

DNA复制是保证细胞将整个基因组正确、完整地传给子代的重要生命过程之一。真核生物的DNA复制过程与原核生物相比， 需要更多的蛋白参与，过程更加复杂，加之真核生物存在染色质结构和细胞周期，存在很多悬而未决的问题有待回答。另外，复制依托众多蛋白之间、蛋白与DNA之间的动态相互作用，传统集合平均的生化研究手段难以从实时动态的层面进行解析，亟需新的方法和技术手段进行补充。本项目针对DNA复制中的基本科学问题，围绕MCM、ORC等真核DNA复制中的关键蛋白复合体，研发适合真核生物DNA复制研究的单分子成像技术和研究体系，解析DNA复制中的分子机制。真核生物的DNA复制需要种类繁多的蛋白参与，将所有的蛋白纯化出来重建体外复制体系难度非常大。首先，我们在该项目中研发了基于细胞核抽提物的酿酒酵母体外生化系统YNPE，YNPE可以在完全模拟生理条件下支持DNA的复制，结合酿酒酵母简便的遗传操作，使得YNPE成为强大的研究系统。我们发展了量子点标记蛋白技术，在单分子水平发现了DNA复制起始过程中ORC等在不同复制起始位点的结合差异，为解析真核生物复制起始的时空调节机制提供了有力的证据。YNPE体系不但支持DNA复制，而且支持与DNA复制相关的核小体形成，DNA损伤修复以及细胞周期的生化反应。 我们利用单分子成像技术观察了核小体在YNPE中形成的动态过程，分析了在生理条件下核小体组装的动力学。DNA复制过程中，DNA复制叉遇到模板上受损的DNA后，会启动DNA损伤耐受（DDT）机制，在不修复受损DNA的情况下完成复制。我们利用单细胞蛋白荧光定位技术，对DDT途径中重要蛋白Rad5的功能进行了探究，第一次发现了Rad5可能在调控细胞采取易错途径还是无错途径的决策上起到了重要的作用，提出了全新的Rad5功能模式。DNA复制过程中引发酶是合成DNA的必要催化酶，我们利用嗜热细菌中独特的引发酶TtDnaG2研发了新的DNA扩增技术。YNPE完全支持细胞周期的生化反应，我们利用不同细胞周期的YNPE，结合热力学计算，发现磷酸势能在细胞周期转换的推动作用，提出了全新的理论。