基于末端保护和银纳米簇的非标记荧光新方法检测小分子与蛋白质相互作用

As promising substitutes for organic dyes and quantum dots, silver nanoclusters have recently attracted great attention in the fields of chemical/biological-sensing, cell imaging and bioassays, mainly because of their advantages such as ultrasmall size (﹤2 nm), good biocompatibility, water solubility and excellent photostability. In this item, firstly, we develop a label-free homogeneous assay strategy for detecting small molecule-protein interactions. The method is based on the terminal protection that a single-stranded DNA scaffold for producing silver nanoclusters (AgNC) tether to a small molecule is protected from the degradation by exonuclease I (Exo I) when the small molecule moiety is bound to its protein target. Further we present a novel fluorescence biosensing strategy, which combines the isothermal DNA ampilification (rolling circle amplification, polymerase-endonuclease chain reaction) with terminal protection assay to develop a high sensitivity, high selectivity, low cost and simplified operations assays for detection of small-molecule and protein interactions. The strategies hold great promise as a versatile, sensitive, simple and robust platform for clinical diagnostics and drug screening.

近年来，银纳米簇（AgNCs）凭借其尺寸小（＜2 nm），良好的生物相容性和水溶性及荧光稳定性，引起了科研工作者的广泛关注，并作为一种潜在的荧光材料代替有机荧光染料和量子点应用于生化传感、细胞成像、生物检测等领域。本项目拟以癌症标志物叶酸受体为模型，发展DNA/AgNCs为一种新型的荧光探针，结合末端保护反应机制，通过被保护的DNA链为模板合成AgNCs，发展无标记、简单、快速的均相荧光新方法用于研究小分子与蛋白质相互作用；在此基础上，将滚环扩增技术、聚合酶-内切酶恒温核酸放大技术、纳米探针技术与末端保护分析结合起来，构建高灵敏度、高特异性、操作简单、成本低的研究小分子与蛋白质相互作用的荧光传感新方法，为临床疾病的早期诊断、药物筛选等提供一个简便实用的新技术平台。

金属纳米簇是由几个到几十个贵金属原子构成的纳米团簇。金属纳米簇凭借其尺寸小（2 nm），良好的光学性质和生物相容性及水溶性，引起了科研工作者的广泛关注，并将其作为有机染料和量子点的有潜力的替代品，逐渐应用于细胞成像、化学/生物检测等领域。本项目以DNA为模板合成金属纳米簇，并以此为信号探针，结合末端保护技术和核酸放大技术，发展了一系列简单、快速、灵敏的荧光生物传感技术，实现对蛋白质、金属离子的灵敏检测。本项目对各种目标物的检测无需采用特殊标记试剂，成本低廉，操作简单，检测快速，灵敏度高，特异性好。同时，该方法的通用性好，能够拓宽到其它生物分子的检测，有望为癌症的早期诊断、临床治疗和药物筛选等领域提供一个简便实用的新技术平台。研究工作总结摘要如下：第一部分：金属纳米簇的合成及应用。以单链或者双链DNA为模板，合成了光稳定性好、发射峰窄、发射波长随团簇尺寸可连续调节的发光金属纳米簇。同时利用发光纳米簇的特殊荧光性质，设计了不同的反应对应的高灵敏的荧光信号转换机制来实现了对金属离子、蛋白质和小分子的检测。第二部分：基于末端保护和核酸扩增技术的超灵敏荧光生物传感新方法研究。以癌症标记物叶酸结合蛋白为检测模型，建立了基于末端保护技术和等温核酸扩增技术的信号放大方法用于检测小分子与蛋白质相互作用。研究发现，叶酸与叶酸结合蛋白的特异性结合，保护叶酸标记的单链DNA不被Exo I水解，作为后续RCA反应的成环模板，引发滚环DNA扩增反应，随后扩增产物与Taqman探针杂交，在核酸外切酶III作用下引发酶切循环放大反应，产生荧光信号，实现了对叶酸结合蛋白的高灵敏性检测。