microRNA-210在小鼠缺血性脑损伤修复中的作用及机制研究

It is lack of effective management for ischemic stroke. MicroRNAs provide a potential novel therapeutic approach for treatment of stroke because of its advantages including small size and multiple targets. Our previous study of blood microRNA profiles in patients with acute ischemic stroke and large clinical investigation demonstrated that microRNA-210 (miR-210), a key hypoxamir, played an important role in ischemia brain injury and repair. MiR-210 level in stroke patients with good outcome was significantly higher than patients with poor outcome. However, in vivo, the function and the mechanism of miR-210 in brain recovery following ischemia are unknown. In present study, we attempted to explore miR-210 function and mechanism in the brain of ischemic-reperfusion mice using lentivector based overexpression miR-210 and antagomir to inhibit miR-210. The hypotheses include: 1) whether miR-210 over-expression can induce infarct volume and improves the long-term outcome in ischemia mice? 2) Whether miR-210 promotes the ischemia brain recovery via angiogenesis and neurogenesis? 3) Whether miR-210 promotes angiogenesis and neurogenesis via la regulation of BDNF and their receptors TrkB or others targets? Our study is useful for better understanding the pathophysiology of post-ischemic injury and repairs and provides a potential novel therapeutic target for stroke.

缺血性脑卒中缺乏有效治疗手段，microRNAs (miR)分子量小且作用靶点多是目前治疗脑缺血损伤的新途径。我们对急性缺血性脑卒中患者外周血miR表达谱的高通量筛选及扩大样本验证结果提示：miR-210与脑缺血发生发展密切相关，是调控缺血性脑损伤修复的关键miR，miR-210外周血含量高则患者长期预后好。然而，miR-210在脑缺血损伤修复过程中的作用机制尚不清楚。本课题将建立小鼠局部脑缺血模型，采用慢病毒过表达miR-210和反义核苷酸抑制miR-210技术，探索1）过表达miR-210能否减小缺血小鼠脑梗死体积并改善动物行为学；2）miR-210的治疗作用是否与促进局部血管新生及神经再生相关；3）miR-210是否是通过下游靶基因BDNF及其受体蛋白TrkB调控脑缺血区血管新生及神经再生。上述研究有助于进一步阐明脑缺血损伤病生机制，也可能为缺血性脑卒中提供潜在治疗新靶点。

近年来，血管新生和神经再生修复治疗脑缺血逐渐受到学者们的重视,寻求优良的促血管神经再生靶点是开展该治疗方式研究的重要基础。先期人们一度将目光投向于各种蛋白水平的分子，但近年来随着小RNA领域的发现，其分子量小以及靶位点多的优势，在某种程度上作为治疗靶位点可能优于蛋白水平分子。在先前的研究中，我们发现miR-210与脑缺血发生发展密切相关。但其对正常和缺血脑组织的作用及机制尚不清楚？miR-210能否在缺血缺氧条件下通过调控BDNF蛋白表达促血管和神经再生？如有促血管和神经再生，是否能减轻脑梗死面积并改善脑缺血小鼠长期预后？我们首先研究发现过表达mir-210能增加正常小鼠脑组织的血管新生和神经再生，主要通过调节VEGF的表达。为进一步明确miR-210对缺血脑损伤及修复的作用及机制，我们建立局部大脑中动脉栓塞再灌注小鼠动物模型，模拟人体脑缺血病理状态，利用慢病毒载体技术过表达miR-210（LV-210），采用立体定位技术对左侧脑基底节区缺血半暗带区注射病毒，观察缺血后28天注射侧血管新生和神经再生情况，并采用神经功能评分及神经行为学测定最终评价其长期治疗作用。结果发现，脑缺血后小鼠的神经功能评分增高；转角实验中转向左侧次数多；转棒实验中转棒停留时间缩短，提示脑缺血对小鼠神经功能的损伤以及动物行为学的影响。而随着时间推移，脑缺血小鼠神经功能评分逐渐下降，转角时向左转次数减少，转棒停留时间也逐渐延长，提示缺血脑组织损伤随着时间推移逐渐呈修复趋势，符合缺血性脑卒中发生发展的病理过程。而LV-210组与LV-GFP对照组相比，发现过表达miR-210在缺血后28天能明显改善脑缺血小鼠的各项动物行为学观察指标。同时，脑缺血后28天LV-210组较LV-GFP组Brdu阳性细胞、CD31阳性血管以及Brdu/CD31共染阳性细胞增多，表明LV-210对缺血半暗带的促血管新生作用；LV-210组DCX阳性细胞较LV-GFP组增多，且向缺血半暗带区移行多，提示促神经再生作用；LV-210组Western Blot定量脑缺血后28天缺血半暗带区mBDNF/ProBDNF比例较LV-GFP组增高，提示脑缺血体内过表达miR-210可能通过调节脑内BDNF成熟体与前体的比值促血管和神经再生，并通过荧光素酶报告基因检测系统验证了BDNF为mir-210直接靶基因，为脑缺血治疗提供新的作用