TTR基因参与玻璃体淀粉样变性发病分子机制的研究

The familial vitreous amyloidosis is a scarce hereditary disease, it is characterised by amyloid substance depositing in vitreous. Recent researches have showed that familial hereditary vitreous amyloidosis is induced by transthyretin (TTR) gene mutation. Our results detected that transthyretin gene mRNA and protein expression in patients with vitreous amyloidosis was lower than those in familial other members , the latter lower than control, a missense mutation of glycine-to-arginine substitution was identified at amino acid position 83 in exon 3, GGC>CGC (Gly83Arg). It was not clear if the pathogenesis related to transthyretin gene mRNA and protein expression, the point mutation percentage related to course of disease, what was hereditary molecule features, and other genes were involved in the process. Transthyretin gene sequencing, the mice model construction expressing mutation gene, quantified polymerase chain reaction, western blot and mRNA and protein expression of transthyretin gene in same patient different period were used to analyse hereditary molecule features and reveal the pathogenesis.

最新的研究表明，TTR基因突变可以导致家族遗传性玻璃体淀粉样变性。课题组前期的工作发现该病患者TTR基因mRNA及蛋白表达水平降低、TTR基因第3外显子3929位的G碱基峰下方均出现一个C碱基峰，形成套峰，表现为部分点突变（G→C））。以上突变位点是否为该病的遗传学分子特征，点突变程度与病程是否相关；TTR基因mRNA及蛋白表达的变化与该病发生发展及突变之间的关系等问题值得进一步深入研究。本项目拟通过检测家系成员TTR基因序列、构建突变型TTR基因小鼠，观察与该病形成的关系，从而确证位于TTR基因第3外显子的83位氨基酸（Gly83Arg）突变是不是该病的遗传学分子特征。采用荧光定量PCR及Western blot技术，检测家系成员TTR基因转录和翻译水平上的变化；分析相同患者不同时期TTR基因表达及部分点突变比例变化，一定程度上揭示TTR基因的这些变化与该病发生发展之间的关系。

目的：本项目拟构建TTR基因Gly83Arg突变基因小鼠，明确该突变位点是否为该病的遗传学分子特征；点突变程度与病程是否相关；TTR基因mRNA及蛋白表达的变化与该病发生发展及突变之间的关系。.方法：通过打靶载体构建、ES细胞培电穿孔DNA转移、ES细胞基因组DNA的提取、同源重组克隆的PCR鉴定等过程构建了TTR Gly83Arg突变的C57BL/6小鼠模型。采用裂隙灯观察模型鼠屈光介质，发现玻璃体浑浊即处死小鼠，采用刚果红染色及偏振光检测淀粉样物质，免疫组化定位检测TTR蛋白；研磨肝脏提取RNA与蛋白质，同时采取家系成员全血，采用荧光定量PCR检测TTR基因mRNA表达、Western Blot检测TTR基因蛋白质表达。.结果：TTR Gly83Arg模型小鼠眼球刚果红染色及偏振光检测，模型小鼠玻璃体淀粉样物质沉积处刚果红染色呈特征性橙红色，偏振光检测呈苹果绿双折光；对照组小鼠玻璃体刚果红染色无特征性橙红色，偏振光检测无苹果绿双折光。TTR Gly83Arg模型小鼠与野生型小鼠心、肝、脑、肾刚果红染色均未见特征性橙红色。免疫组化结果：TTR Gly83Arg模型小鼠心、肝、脑、肾 模型小鼠心、肝、脑、肾免疫组化结果，均为阴性，无特征性棕色，野生型小鼠肝脏细胞为阳性，细胞质内呈颗粒样分布，呈棕色，余为阴性。.结论：（1）TTR Gly83Arg确为家族遗传性玻璃体淀粉样变性的分子学特征且仅表现为眼部发病；（2）TTR Gly83Arg突变的C57BL/6小鼠模型建立成功，该品系小鼠可用于家族遗传性玻璃体淀粉样变性的研究；（3）TTR基因mRNA及蛋白表达降低，其变化规律如下：患者TTR基因mRNA及蛋白表达＜家系中未发病成员<非家系正常人，随着患病时间的延长TTR基因mRNA及蛋白表达进一步降低；（4）家族遗传性玻璃体淀粉样变性随年龄的增长而发病，40岁以后多发。