3种兰科植物及其基部物种拟兰MADS基因家族比较基因组研究

Genetic mechanism of flower diversity of Orchidaceae are still unknown. MADS gene family play important regulated role in flower development. The study on the structures, expression and functional evolution of MADS gene can help us to explain the genetic mechanism and evolution pattern of plant floral organogenesis and diversity. An basal species of Orchidaceae, Apostasia odorata, is important role in phylogeny of orchid family. In this study, we will discuss the molecular evolution, functional differentiation and the relationship of MADS genes family comparing Apostasia odorata with 3 species, Phalaenopsis equestris，Dendrobium officinale, Erycina pusilla, using the method of comparative genome for exploring floral shape diversity of orchid. We will analyze the structure and collinearity of MADS gene and so on, using bioinformatics for the evolution model, using transcriptome for comparing the expression model among 4 species, using real time PCR and in situ hybridization to find the highest expression gene in flower organs, especially in labellum among 4 species, study on over expression, CRISPR/CAS9 gene knock-out and promoter deletion expression of 1 to 2 gene that are the highest expression in labellum of Dendrobium officinale as represent genes to understand the functional differentiation mechanism of coding region and transcriptional activity of promoter region for providing the insight into mechanism of origin, evolution and diversity in Orchidaceae for future.

兰科花多样性形成遗传机理迄今仍未解决。MADS基因家族在花器官发育过程中起重要调控作用，其基因结构、表达及功能进化在阐述植物花器官发生和花形态多样性形成机理中具有重要作用。拟兰为兰科基部物种，在兰科植物系统演化中具不可替代位置。本研究以拟兰为主线，利用比较基因组学对拟兰、铁皮石斛、小兰屿蝴蝶兰、扇形文心兰MADS基因家族分子进化和功能分化及其关系进行探讨，以期阐明4种兰科植物唇瓣多样性形成遗传机理。用生物信息学分析拟兰与3个物种MADS基因的结构、共线性等，研究进化历史；用转录组比对4个物种间MADS基因差异表达模式；用荧光定量PCR及RNA原位杂交找出在4个物种花器官中高表达MADS基因；以铁皮石斛唇瓣中强表达1-2个基因为代表，通过编码区过表达、CRISPR/CAS9基因敲除和启动子分段缺失表达验证编码区功能和启动子转录活性；为探索兰科植物的起源、分化和多样性形成机制提供信息。

兰花花朵多样性除了吸引昆虫授粉外，具有很高观赏价值，但其机理不清楚。本项目利用比较基因组对拟兰、铁皮石斛、小兰屿蝴蝶兰、扇形文心兰MADS基因家族分子进化和功能分化进行研究。进化树分析表明，拟兰为基部物种，铁皮石斛、扇形文心兰、莲瓣兰互为姐妹支，但铁皮石斛位于基部；蝴蝶兰品种间单独为一支，处于进化树上端，进化程度最高。分析拟兰与3个物种MADS基因的结构、共线性等，发现由于受到选择压力作用，拟兰和铁皮石斛的收缩基因家族大于扩张的基因家族，导致拟兰和铁皮石斛在我们研究的这几个物种进化树中处于基部。就MADS基因而言，铁皮石斛、小兰屿蝴蝶兰和扇形文心兰在进化过程中经历基因的复制均多于拟兰，可能是兰花由辐射对称向两侧对称转化的一个重要因素。另外，这些复制的基因发挥了不同的功能，导致本项目研究的4种兰花花朵表型产生了巨大差异。转录组比对4个物种间MADS基因差异表达模式，发现MADS基因家族的B类基因AP3-1和AP3-2基因在拟兰中高表达，而AP3-3基因无表达，其原因是拟兰基因组中丢失了AP3-3基因。铁皮石斛AP3-3基因表达量低于小兰屿蝴蝶兰和扇形文心兰；拟兰基因组中有SEP1-4,但花朵转录组中没有SEP2、SEP3、SEP4基因表达，铁皮石斛SEP3表达量低于小兰屿蝴蝶兰和扇形文心兰，推测拟兰无舌瓣以及兰花舌瓣的相对大小与AP3-3和SEP3表达量有关，从而导致拟兰花被处于祖先状态。用荧光定量PCR及RNA原位杂交进一步验证AP3-3、SEP3基因在4个物种花器官中表达，其研究结果与转录组分析结果一致。以AP3-3和SEP3基因为代表，通过编码区过表达、CRISPR/CAS9基因敲除，观察铁皮石斛及黑毛石斛×鼓槌石斛杂交种花型变化，结果表明花型发生明显改变。通过启动子分段缺失表达研究，发现AP3-3启动子和SEP3启动子在全长序列时转录活性最强。补充构建了MADS差异表达基因蛋白质调控网络，结果表明部分MADS基因家族成员与激素传导通路关键基因互作。本项目研究结果揭示了兰科植物的起源、分化和多样性形成部分机制。