云南墨兰多舌奇花MADS－box基因的功能和进化研究

It is very important to research the molecular mechanism of how the peloric mutant flowers of Chinese orchid formation because of its highly ornamental and economical value, but this research is limited. The over expression of B function MADS-box genes plays important role in multi-petal flower formation of plant, However, there is not report in orchid. In this project, based on 6 ESTs sequence of B function MADS-box PI/GLO Paralogs genes that had been got from differential screening between peloric mutant flower of multi-labellum of Cymbidium sinensis and wild flower of Cymbidium sinensis　in Yunnan, we will use Race technique to clone full-length genes, use biological software to analyze 6 cDNA full-length sequences and predict their structures and properties of protein, use OneKP dataset and PuTTY software to construct molecular phylogenetic tree for research gene evolutionary history so as to understand gene duplication and differentiation process and mechanism of function of gene, use Real-time quantitative PCR and RNA situ hybridization to explore specific expression of these 6 genes in different tissues of orchid, transform specific expression genes in multi-labellum into Arabidopsis thaliana to research gene's function. All above researches are about to explore whether the production of multi- labellum is related to over expression of B function gene or not, try to reveal part of molecular mechanism of the multi- labellum peloric flower formation through these research of gene function.These research will provide theory basis for reform and cultivation new and peculiar varieties of Chinese orchid through using molecular genetic methods.

国兰奇花具有很高的观赏价值及贸易价值，对奇花产生的分子机理研究具有重要意义，但目前对其研究很有限。B类MADS基因超表达在植物重瓣花形成中具有重要作用，但兰花中并无研究报导。本项目在云南墨兰多舌奇花突变体与野生型差异筛选获得的6个上调表达并推测为B类PI/GLO旁系同源基因ESTs序列的基础上，用Race技术克隆全长基因，用生物软件分析6个cDNA全长序列并预测蛋白质结构与特性；结合OneKP数据库和PuTTY软件构建兰花MADS基因家族大型分子进化树，研究基因进化历史，探索基因重复及随后其功能分化过程和机制；用荧光定量PCR与RNA原位杂交技术研究这6个基因在兰花不同组织部位特异性表达；筛选在多舌中特异表达基因转化拟南芥；研究该墨兰多舌奇花产生是否与B类基因超表达有关，可望通过对这些基因功能研究揭示该多舌奇花形成的部分分子机理，为分子遗传改造培育中国兰花新奇优良品种提供理论依据。

MADS基因家族在兰花中扮演重要作用。本项目用Race技术克隆了6个MADS基因家族成员，分别为B类基因中的PI和AP3基因，C类基因中的AG基因，E类基因中的SEP、SEP3基因和AGL6基因。荧光定量PCR显示：AG在合蕊柱中高表达。AGL6在花器官各部位均有不同程度的表达，以合蕊柱和萼片中最高。SEP在小舌、鼻头以外的花器官中高表达，参与花器官的发育。AP3仅在萼片和捧瓣中高表达，可能与唇瓣特异有关。PI在鼻头外的所有花器官中均有较高的表达，而在营养器官中表达较低, SEP3与PI相似, 在鼻头外的所有花器官中均有较高的表达，而在营养器官中表达较低。初步确定这6个基因可能在花器官的发育中扮演重要作用。构建6个MADS-box基因的过表达载体，遗传转化拟南芥，表型观察表明：SEP基因导致苗长势非常弱，最后死亡；AG基因和 AP3基因没有表型变化，而PI、SEP3、AGL6显著作用于墨兰营养生长，部分line 有叶片上卷表型，导致植株早衰，植株比对照小，开花期提前，花朵比对照明显变小，但花型没有明显变化，研究结果与前人在拟南芥，金鱼草中的研究存在巨大差别。研究结果对解析兰科花器官发育在进化过程中的多样性具有重要的意义。墨兰MADS基因家族为包含来自同一物种的多个旁系同源物的进化分枝，包括了AP3/PI、AP1/FUL、AGL12、MIKC*、SOC、AG、SEP、SV、AGL17、CFO、AGL6、Mδ，但没发现到Mα，Mβ。基于MADS基因家族序列，构建了几个兰科物种进化树，拟兰为基部物种，铁皮石斛、扇形文心兰、墨兰为一支，互为姐妹支，其中，铁皮石斛为其它2个物种更基部，墨兰相对进化程度高。蝴蝶兰品种间为一支，进化程度相对于本次研究物种中最高的。墨兰扩张的基因多于收缩基因，其中扩张的基因4929个，收缩基因461个。就B类基因而言，墨兰扩张基因多于兰科祖先物种拟兰的基因，可能是兰花由辐射对称向两侧对称转化的一个重要因素。补充构建了PI基因CRISPR/Cas9基因编辑载体，建立了铁皮石斛遗传转化体系，获得PI基因过表达及CRISPR/Cas9基因编辑阳性铁皮石斛阳性苗，经测序表明，CRISPR/Cas9基因编辑铁皮石斛阳性苗在2个设计的靶点序列之间产生7个序列缺失，其中4个碱基缺失发生在内含子处，3个碱基缺失发生在外显子处，说明基因编辑发生了作用。