野大麦HbCIPK2介导的盐离子和渗透平衡调控机理研究

本项目为了更好地了解野大麦HbCIPK2介导的高盐、干旱胁迫调控机理，在获得HbCIPK2过表达拟南芥转基因株系的基础上，分析高盐/干旱单因子及其双因子胁迫下下游靶基因的表达与其调控关系；构建HbCIPK2反义或RNAi表达载体，研究HbCIPK2在野大麦中被抑制与抗逆性的关系；构建含不同功能域的HbCIPK2表达载体，通过激酶活性分析和转化拟南芥敏盐突变体，确定HbCIPK2调控耐盐性的关键功能域；然后通过BiFC活体和Yeast two-hybrid离体验证HbCIPK2调控盐离子和渗透平衡特异作用的靶蛋白及与靶蛋白作用的HbCIPK2功能域，进而阐述HbCIPK2协同调控盐离子平衡和渗透平衡的分子机理，并探讨其分子育种价值。该研究将为植物抗逆调控研究提供新的遗传信息，为作物抗逆遗传改良提供具有自主知识产权的新基因。因此，本项目具有相当重要的理论意义和潜在的应用价值。

本项目经过3年研究，明确了野大麦HbCIPK2的生物学功能和调控机理。主要研究结果如下：1）研究表明，该基因在野大麦基因组中不具有内含子，是单拷贝基因；在干旱、高盐和ABA胁迫下表达增强，而其表达不受冷胁迫影响；其编码蛋白主要定位于细胞质膜和细胞核。HbCIPK2在拟南芥野生型过表达后转基因株系耐盐性增强，在拟南芥敏盐突变体sos2-1中过表后转基因株系敏盐性被抑制，且二者的转基因株系在干旱条件下发芽率均提高。与对照株系相比，HbCIPK2不论在野生型还是突变体中过表达均可维持转基因株系根部较高K+含量，地上部相对较低Na+含量；同时，证明HbCIPK2可保护转基因株系根尖分生组织细胞不因高盐胁迫而死亡；Microarray分析表明，在胁迫条件下HbCIPK2可调控一些与抗旱耐盐相关基因的表达。2）构建了HbCIPK2的RNAi干扰表达载体2个，通过农杆菌介导的方法获得野大麦转基因株系，正在鉴定其抑制表达后的生物学功能。3）HbCIPK2作为诱饵蛋白，筛选了野大麦高盐和干旱胁迫酵母双杂交cDNA文库，同时结合Yeast two-hybrid离体和BiFC活体验证，确定了与HbCIPK2特异作用的上游靶蛋白3个和下游靶蛋白4个，其构成了调控盐离子平衡和渗透平衡的调控通路；并且初步确定了HbCIPK2与上下游靶蛋白互作的关键功能域。特别是下游靶蛋白的发现及HbCIPK2互作功能域的确定，为解释HbCIPK2调控K+/Na+平衡及渗透平衡提供了有力证据。