野大麦HbCIPK2与其互作蛋白构成调控通路的功能解析

Under supports of previous NSFC, a novel gene HbCIPK2 has been identified to be associated with salt and drought tolerance, its encoding protein interacts with upstream HbCBL1, HbCBL4 and HbCBL10, as well as downstream HbSOS1 and HbHAK1 from Hordeum brevisubulatum, respectively. However, it is still poorly understood if these interacting proteins constitute new pathways and what roles the pathways play in plant. This project will focus on the biological functions of HbCIPK2-mediated pathways through reconstitution in yeast mutant and Arabidopsis system. The aims are 1) to confirm which domains of upstream proteins (HbCBL1, 4, 10) and downstream proteins (HbHAK1 and HbSOS1) interact with HbCIPK2, and which sites of them are phosphorylated by HbCIPK2; 2) to analyze what roles these interacting domains and phosphorylated sites play in K+/Na+ homeostasis, protein interaction and the HbCIPK2-mediated pathways; 3) to dissect the functions of different HbCIPK2-mediated pathways and cross-talk between them. Based on these results, the HbCIPK2-mediated pathways different from that in model plant will be first identified in Hordeum brevisubulatum, especially, the mediation of HbHAK1 by HbCIPK2 will set up new insights into the regulation of abiotic stress in plant, and provide new ways for the improvement of abiotic stress tolerance in crop.

在前期项目资助下，从盐生野大麦挖掘鉴定出耐盐、抗旱HbCIPK2基因，并筛选出与其互作的上游蛋白HbCBL1、4、10及下游蛋白HbSOS1和HbHAK1。但这些互作蛋白是否构成新的调控通路、调控通路又具有哪些生物学功能都还不清楚。本研究拟通过酵母突变体和拟南芥不同体系研究野大麦HbCIPK2介导的调控通路的生物学功能，确定HbCIPK2与上下游蛋白互作的关键功能域及磷酸化位点，分析HbHAK1等上下游蛋白磷酸化位点的功能、对互作的影响以及在调控通路中的作用，揭示由HbCIPK2介导的不同调控通路的作用与关系。该研究将首次鉴定不同于模式植物的野大麦HbCIPK2介导的调控通路，特别是HbCIPK2与HbHAK1调控关系的研究，将为植物抗逆调控研究提供新的遗传信息，为植物抗逆遗传改良提供新的策略和方法。

干旱和土壤盐渍化是农业可持续发展的主要环境限制因素。本项目以挖掘具有重大应用价值的抗旱耐盐基因及明确其应用策略为出发点，选取特殊生境种质-盐生野大麦为材料，在前期研究基础上，以筛选出的抗旱、耐盐蛋白激酶HbCIPK2为诱饵，鉴定出上下游互作蛋白，研究这些蛋白及其构成的调控通路的生物学意义。目前获得结果如下：.（1）以HbCIPK2为诱饵蛋白，筛选野大麦高盐、干旱胁迫的酵母cDNA文库，结合酵母一对一双杂交、细胞学水平BiFC和生化水平CoIP等验证，确认上游蛋白HbCBL1、4和10分别与HbCIPK2相互作用，且三者与HbCIPK2互作主要发生在细胞质膜上，HbCBL1与HbCIPK2互作强于HbCBL4和10；下游蛋白HbAKT1、HbSOS1和HbFd1分别与HbCIPK2互作，且三者的C-端是与HbCIPK2互作的关键部位。.（2）HbCBL1、4和10均定位于细胞膜，HbCBL4主要在根部表达，HbCBL10主要在茎叶表达，HbCBL1不具组织表达特异性；HbCBL4和10响应多种逆境胁迫，且在高盐胁迫下根部表达量极显著增加，而HbCBL1表达量则降低。功能分析表明，HbCBL1不能调控植物的耐盐性，而HbCBL4和10均可调控植物的耐盐性。.（3）细胞电生理和酵母功能互补实验表明，HbCBL1和HbCIPK2组合可以特异地调控HbAKT1的转运活性，其对K+的转运依赖于外界K+的浓度；HbAKT1可以特异性地转运K+，而对Na+、Li+、Cs+其他一价阳离子没有转运功能，对Mg2+也没有转运活性，而对Ca2+离子有弱的转运活性。HbCBL4和10分别与HbCIPK2组合调控HbSOS1对Na+的转运活性。由此，HbCIPK2作为调控枢纽,构成了HbCBL1-HbCIPK2-HbAKT1和HbCBL4/10-HbCIPK2-HbSOS1调控通路，实现了对K+/Na+平衡的协同调控。.本项目最大的亮点是鉴定出协同调控K+/Na+平衡的通路，并发现存在交叉，HbCIPK2为调控枢纽，同时与参与细胞代谢的HbFd1互作，这些发现不同于已报导的模式植物K+或Na+调控途径，这可能是盐生植物特有的调控机制，将丰富植物抗逆理论，并为作物遗传改良提供新的基因资源和改良策略。