致突变性消毒副产物对细菌抗生素抗性的影响及其机理研究

The antibiotic concentrations in drinking water are extremely low, usually at the level of ng/L. However, substantial bacterial antibiotic resistance (BAR) still occur in such an environment. The applicant proposes a hypothesis that mutagenic disinfection byproducts (M-DBPs) may be an important factor for inducing the increase of the BAR in drinking water after disinfection, which is based on the pathways how bacteria acquire the antibiotic resistance and the principles how the M-DBPs generate mutagenesis. The followings will be investigated: the qualitative and quantitative analysis of the effect of M-DBPs on BAR; the roles of external conditions, e.g. planktonic or attached growth type for bacteria, the co-existence with low-level antibiotics, in the process of the BAR inducement by M-DBPs. The intrinsic mechanism will also be studied including the sequencing of antibiotic resistance genes and gene clusters to identify mutation loci and the occurrence of multi resistance mutation, and the analysis of the fitness cost induced by mutations. Hopefully the results will elucidate the increase of relative and absolute abundance of BAR in drinking water after disinfection; the mechanism of BAR formation under an extremely low antibiotic selective pressure will also be supplemented. Meanwhile, this newly established link between the toxicological safety and the microbiological safety will provide novel visual angle and scientific foundation for systematically control of drinking water safety.

饮用水中抗生素的浓度一般在ng/L的极低水平，但其中的细菌仍然存在着较为显著的抗生素抗性。申请者从细菌获得抗性的途径和部分消毒副产物具有致突变性的原理出发，提出致突变性消毒副产物（M-DBPs）的致突变作用可能是消毒后饮用水中细菌抗生素抗性（BAR）提高的重要原因。项目将研究M-DBPs对BAR的定性和定量影响；研究细菌存在形式（悬浮态或生物膜）以及低水平抗生素共存等外部环境因素在M-DBPs诱导BAR过程中的作用；并通过对相关抗性基因及基因簇序列的分析判断是否有抗性突变发生和是否为多重抗性突变，以及分析抗性突变后的适应度成本等。研究结果不仅可以来解释消毒后饮用水中部分BAR相对和绝对水平上升的现象，补充和完善人们对极低抗生素选择压力下BAR生成机制的认识，同时将在饮用水遗传毒理学安全性和微生物学安全性的研究之间建立起联系，从这一新的视角为饮用水安全性的系统控制提供科学依据。

饮用水中抗生素的浓度一般在 ng/L 或低于检出限的极低水平，但其中的细菌仍然存在着较为显著的抗生素抗性。本项目从细菌获得抗性的途径和部分消毒副产物具有致突变性的原理出发，提出致突变性消毒副产物(M-DBPs)的致突变作用可能是消毒后饮用水中细菌抗生素抗性(BAR)提高的重要原因的假设；并对这一假设进行了系统的证明，对其机理进行了探讨。得到如下主要结论：..（1）MX等典型致突变性对模式菌株P. aeruginosa PAO1的10种临床常用抗生素的单一抗性均有不同程度地提高，且具有明显的剂量-效应关系。M-DBPs对BAR的提高效果与其致突变性强弱正相关。近年来作为新兴污染物受到较大关注的含氮DBPs（N-DBPs）对受试菌株抗生素抗性的提高作用普遍高于C-DBPs。典型M-DBPs对受试菌株多重抗性的提高作用也较为显著。..（2）实验体系中加入活性氧物质（ROS）猝灭剂后，M-DBPs对抗性的提高作用几乎消失，证明ROS在上述诱导过程中发挥了重要作用；ROS是基因突变的重要诱因，而后续对相关抗性基因的测序结果证明了突变的发生。突变结果是抗生素靶位点的改变和外排泵活性提高，并以外加外排泵抑制剂的方法证明了后一机制。..（3）以饮用水中含量较高的一般DBPs、遗传毒性较高的碘代DBPs，以及饮用水浓缩液进一步证实了M-DBPs对P. aeruginosa的单一抗生素抗性及多重抗性。将受试菌株扩展到E. coli，可观察到同样的结果。以此证明了实际饮用水环境中广泛存在的DBPs可能诱导环境微生物包括水传病原微生物提高对抗生素的抗性。..（4）通过抗性菌株与敏感菌株在不同营养环境中的竞争性培养实验，发现M-DBPs诱导抗性突变株的抗性在贫营养条件下，适应度代价存在减小甚至消失的现象。..本研究揭示了饮用水中细菌获得抗生素抗性的一条被忽略的途径，有助于解释极低抗生素水平下的饮用水环境中细菌抗生素抗性水平相对较高的现象，并建立了饮用水关于DBPs的化学/毒理学安全性研究与关于细菌抗生素抗性的生物安全性研究之间的联系，为全面理解和控制饮用水安全提供了新的思路。