亚硒酸化β-乳球蛋白真空氧化还原导入机制及其抗衰老机理研究

Selenium(Se) is an essential element for organisms. Interest in selenium-containing therapeutics has grown over in recent years. The beneficial effect of Se is not only dose-dependent, but also relates to the chemical form of the element and its bioavailability. It is strongly suggested on the basis of a higher retention and a lower toxicity, that organic Se is more recommendable than inorganic Se in supplementation. β-lactoglobulin is the major whey protein of ruminant species containing 3 arginine residues. In the study, a novel seleno-β-lactoglobulin will be synthesized at low temperature under vacuum conditions using our unique patent technology. Conformational changes of β-lactoglobulin under different reactive conditions will be investigated. The mechanism of selenium dioxide (SeO2) specific binding to arginine residues in β-lactoglobulin will be analyzed using fluorescence, circular dichroism, FITR, 1H NMR，13C NMR， ESI-MS and X-ray crystallography technologies. In recent years, selenoproteins are thought to be played important roles in preventing aging and aging-associated diseases, e.g. Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). The effects of seleno-β-lactoglobulin on the aging mice will be detected by immunohistochemistry, in situ hybridization, real-time PCR, immunofluorescence, Western blotting, flow cytometry, confocal live cell imaging. This study will reveal the potential use of a novel selenium compound (seleno-β-lactoglobulin) as an anti-aging agent and provide information on its possible mechanism.

研究表明硒元素与衰老及衰老相关疾病密切相关，近年来备受瞩目。β-乳球蛋白一度被认为是乳酪、干酪等乳制品加工的废弃物。将β-乳球蛋白与SeO2化合制备新型亚硒酸乳球蛋白，将成为一种价廉、安全、易开发的新型有机硒产品，有利于硒和β-乳球蛋白的共同开发利用。本项目主要将β-乳球蛋白与SeO2等比共溶，在真空低温条件下通过氧化-还原将亚硒酸导入到β-乳球蛋白的精氨酸残基的氨基上得到亚硒酸β-乳球蛋白。利用荧光光谱、圆二色性、红外光谱、1H和13C核磁共振光谱、电喷雾质谱（ESI-MS）、X-射线衍射等技术研究亚硒酸β-乳球蛋白的空间结构和真空条件下β-乳球蛋白的空间结构。采用免疫组化、免疫印迹、原位杂交、RT-PCR、免疫荧光、流式细胞仪、激光共聚焦等技术研究亚硒酸β-乳球蛋白的抗衰老机制。本研究不仅对有机硒化蛋白的研制具有重大理论意义，而且对"健康老龄化"具有重大的社会现实意义。

硒元素与衰老密切相关，近年来备受瞩目。β-乳球蛋白一度被认为是乳酪、干酪等乳制品加工的废弃物。制备亚硒酸化乳球蛋白，将成为一种价廉、安全、易开发的新型有机硒产品，有利于硒和β-乳球蛋白的共同开发利用。.首先，在真空低温条件下合成亚硒酸化β-乳球蛋白，合成条件为-0.1Mpa，时间5h，温度40℃，pH值为3。通过FT-IR检测发现亚硒酸化β-乳球蛋白在878cm-1和1043cm-1处新增较强谱带，分别归属于Se=O和Se-O。CD色谱结果显示亚硒酸化β-乳球蛋白的α-螺旋增加9%，β-折叠减少了14.2%，β-转角减少了6%，无规则卷曲增加了11.2%。NMR分析结果证明三级结构也发生了改变。2D-PAGE显示亚硒酸化β-乳球蛋白含有两种蛋白，且分子量呈两倍关系，MALDI-TOF-MS进一步分析表明，这两种蛋白的一维肽指纹图谱高度一致，得出亚硒酸在与β-乳球蛋白反应时，一些亚硒酸只与一个β-乳球蛋白相连接，另一些可以连接两个β-乳球蛋白。.其次，对亚硒酸化β-乳球蛋白诱导K562细胞凋亡的现象进行研究。MTT实验结果表明100 μg/mL亚硒酸化β-乳球蛋白作用K562细胞48 h后，抑制率达到90 %。HE染色和PI/Hoechst双染显示亚硒酸化β-乳球蛋白使K562细胞出现体积缩小、核质分离、出现凋亡小体等典型的凋亡现象。流式细胞术结果表明亚硒酸化β-乳球蛋白能够使细胞被阻滞于G2/M期。通过免疫荧光实验、western blot和real-time PCR表明K562细胞的cyclinB1蛋白及其mRNA水平显著降低，p21蛋白及其mRNA水平显著上升。.最后，进行了亚硒酸化β-乳球蛋白的急性和亚急性毒理试验，结果表明亚硒酸化β-乳球蛋白对昆明种小鼠的半数致死量（LD50）为15.44mg Se/kg。亚硒酸化β-乳球蛋白能缩短D-半乳糖衰老小鼠寻台潜伏期，增加穿越平台的次数。亚硒酸化β-乳球蛋白能够提高GSH-Px和SOD的活性，减少各组织中MDA的含量。脑、肝脏组织的real-time PCR实验结果表明中剂量组小鼠脑、肝脏组织中的SOD1 和GPx1的表达量明显升高。.总之，在真空低温条件下可以合成亚硒酸化β-乳球蛋白，它在体外能够有效的抑制K562细胞的增殖并且诱导其凋亡，还能明显的延缓D-gal致衰老小鼠的衰老进程。