基于OSMAC方法探索滨海植物来源共生曲霉菌D的化学多样性研究

This project focuses on the discovery of chemical diversity from the symboint strain Aspergillus fumigatus D associated with Edgeworthia chrysantha Lindl. collected from the coast of Hangzhou Bay using the One Strain-Many Compounds (OSMAC) method and the biosynthesis of this fungus derived-leading compound, chloro-perylenequinonoid by molecular biotechnology. Firstly, crude fermentation extract will be prepared through four culture modes, including liquid, solid, co-culture with other strain and adding enzyme inhibitor. By bioassay-guided fractionation, all secondary metabolites of crude extracts will be fast isolated and purified using modern chromatography technique. And their chemical structures will be elucidated by a combination of spectroscopy method, single crystal diffraction, optical rotation, classical chemical reaction(s) or other techniques. In vitro actimicrobe tests and cytotoxic assay will perform on all natural products, which the tumor cell lines include human lung adenocarcinoma c A549, breast cancer MCF-7 and cervical carcinoma Hela, and the human pathogenic microbes include Escherichia coli, Staphyloccocus aureus and Candida albicans. Their structure-activity relation will be established on basis of their biological properties. It would afford several leading compounds with new structure and/or potent bioavtivity. As a example of the leading compound chloro-perylenequinonoid derived from A. fumigatus D, its biosynthetic pathway will be clarified through the feeding isotope labeled substrates. Its biosynthetic gene cluster mainly focuses on polyketide synthease (PKS) and chloride enzyme. And theirs genes function will be analyzed using HPLC, RT-PCR and fouorescent qPCR. In order to increase chloro-perylenequinonoid yield, the fermentation condition of A. fumigatus D will be optimized. This would provide a good reference for the scale-up production of chloro-perylenequinonoid through scaleup fermentation.

本项目以一株杭州湾滨海植物结香来源的共生烟曲霉D为研究对象，运用OSMAC方法探索其化学多样性及其生物活性，采用同位素底物饲喂试验和分子生物学技术研究该菌次生代谢产物—氯代苝醌的生源合成途径和生物合成机理。研究首先采用液体培养、固体培养、共培养和添加酶制剂四种方式制备烟曲霉D发酵萃取物，并在活性指导下利用现代色谱技术快速分离次生代谢产物，综合运用波谱技术、单晶衍射技术、旋光测定、经典化学反应等解析其化学结构。利用MTT法和梯度稀释法分别评价单体化合物体外抗菌和细胞毒活性，分析其构效关系，以期获得若干种结构新颖和/或活性显著的化合物。生物合成研究采用同位素标记底物饲喂试验阐明氯代苝醌的生源合成途径；通过同源基因敲除建立双交换敲除菌种，结合HPLC、RT-PCR和荧光定量PCR技术，研究相关基因功能，明确氯代苝醌生物合成机理；通过优化发酵工艺条件提高氯代苝醌效价，为其扩大发酵生产提供参考。

人类现有治疗药物不能满足新疾病（e.g.耐药性致病菌、耐药性肿瘤等）的治疗需求，加强探索和开发新型天然药物显然已成为全球药物工作者最重要的科研任务。微生物次级代谢产物是药物先导物和新药的重要来源之一，然而，近40年来，微生物来源的新型活性次级代谢产物特别是药物先导化合物的数量越来越少，严重影响了创新药物的研究与开发。随着科学技术的发展，基因组学、生物信息学、基因工程技术等在微生物次级代谢及其代谢产物研究得到了广泛应用，发现了在正常培养条件下微生物大部分次级代谢产物生物合成基因簇（BGCs）处于“沉默”或低水平表达状态，导致其次级代谢产物化学多样性低，大量已知化合物重复被发现。同时，前期研究发现OSMAC（一菌多物）策略是提高微生物次级代谢产物化学多样性最有效的办法之一，但该策略在BGC含量十分丰富的曲霉菌中应用鲜有报道。.本项目针对这一问题，以一株滨海植物内生曲霉菌株D为研究对象，利用两种发酵方式（固态和液态）和不同培养基共制备了10种发酵提取物，采用现代色谱技术共分离到57个单体化合物，综合运用各种波谱技术、X单晶衍射分析、ECD光谱分析、文献数据对照等，确定了44个化合物结构（1-44），其中新化合物2个，首次确定化合物绝对构型2个；通过基因组测序、生物信息学分析和基因敲除试验，初步验证了萘并吡喃酮及其二聚体的初始生物合成途径；通过体外抗菌评价，发现了具有显著抗菌和抗肿瘤细胞活性的化合物8个，其中化合物1-6具有显著抑菌（大肠、白念和金葡）广谱性（MIC值≤2 ug/mL），而化合物12和13抑制幽门螺杆菌专一性强（MIC值≤4 ug/mL），成药潜力大，为开发新型抗感染药物提供重要参考。本项目研究任务已完成，目前已累计发表论文11篇，其中SCI类8篇、核心期刊类1篇、会议论文2篇，获授权国家发明专利2项；完成培养硕士研究生6人，其中4人荣获校级优秀毕业研究生。