CDK5磷酸化锚蛋白Ankyrin B调控神经元极性建立和轴突导向的机制研究

Neuronal polarity is the structural basis of neuronal functional. Asymmetric distribution of the axonal proteins was regulated by protein kinases,such as CDK5 etc., but the mechanism is not clear yet. In this project, we used iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantification) and MS/MS to draw the substrate spectrum of CDK5 phoisphorylation sites in axonal growth cone. Furthermore, we study the molecular mechanism of CDK5-mediated phosphorylation of Ankyrin B in axonal polarity formation and asymmetric distribution in growth cone. We intende to identify the CDK5 phosphorylation sites on Ankyrin B. To test the asymmetric distribution of Ankyrin B in axonal development, and it's relationship with CDK5-mediated phosphorylation. To investigate the correlationship between the binding/unbinding of Actin/spectrin skeleton network and integral membrane protein L1CAM, and CDK5-mediated phosphorylation/dephosphorylation of Ankyrin B. To detect the local asymmetric activation of CDK5 and subsequent phosphorylation of Ankyrin B in grownth cone durin stimulation of axon guidance cues, such as BDNF or Slit. To investigate activation of CDK5/Ankyrin B signalling, and consequtntly, axon collapse and neuronal apoptosis in the mouse substantia nigra neurons in Parkinson's disease models. This study reveals the molecular mechanism of neuronal polarity formation, axons differentiation and axon guidance. And provides theoretical reference for the developing nervous system, and provide a new therapeutical strategy for nerve damage and degenerative diseases.

神经元极性建立和轴突导向的分子机制一直是神经发育和疾病中亟待回答的问题，CDK5可极性表达于生长锥，参与轴突的分化和导向等生理过程，并与神经退行性病、损伤等疾病早期的轴突萎缩相关，但具体机制尚需研究。我们应用定量磷酸化蛋白质谱联合生物信息学绘制了生长锥CDK5磷酸化底物图谱，并对其中关键分子锚蛋白B（AnkB）的磷酸化调控轴突分化导向在生理及疾病中的分子机理做深入探讨，希望通过证明：①CDK5可以磷酸化AnkB的S1923和S3819位点；②生理状态：神经元发育中，S1923磷酸化介导AnkB的440-KD剪切异构体在轴突中极性分布，参与轴突分化；成熟神经元中，生长锥局部 S3819磷酸化/脱磷酸化介导细胞骨架网络与细胞膜的锚定和解锚定，参与轴突导向；③病理状态：在帕金森氏病早期CDK5过度磷酸化AnkB参与黑质神经元早期轴突退变；为神经系统发育、疾病的研究提供新的研究思路和药物设计靶点。

目的：轴突导向过程中生长锥细胞骨架重排，在导向侧和非导向侧不对称分布促进轴突靶向生长，但其机制仍不清楚。我们前期研究轴突生长锥磷酸化蛋白质谱，提示锚定蛋白Ank2-440可能是细胞周期素依赖性蛋白激酶5（CDK5）的底物。本课题主要研究CDK5是否磷酸化Ank2-440参与轴突导向过程及分子机制。方法：小鼠皮层组织磷酸化蛋白质谱检测Ank2-440可能的磷酸化位点，并预测其上游激酶；应用体外激酶实验和磷酸化抗体验证CDK5磷酸化Ank2-440；应用BDNF处理CGNs建立轴突导向模型，观察磷酸化Ank2-440在生长锥导向侧和非导向侧的分布情况；应用Ank2抗体免疫沉淀CDK5KO和CDK5WT小鼠皮层组织裂解液，质谱检测差异表达蛋白并进行基因功能分析，并对筛选出的与轴突导向相关的蛋白crmp1和cofilin1进行功能验证。结果：小鼠脑组织蛋白磷酸化质谱检测到Ank2-440的30个磷酸化位点，软件预测CDK5磷酸化Ank2-440 TD结构域的多重磷酸化位点；体外激酶和磷酸化抗体证实CDK5可在体外磷酸化Ank2-440；BDNF处理CGNs建立轴突导向模型中，处理不同时间磷酸化Ank2-440显著增强，p-Ank2-440在导向侧和非导向侧呈不对称分布，上述现象可被CDK5抑制剂Roscovitine抑制； 质谱检测与Ank2-440相结合的蛋白，上调的差异蛋白40种，下调差异蛋白共22种，GO分析提示差异蛋白在分子功能方面主要为细胞骨架结合类蛋白、离子结合类蛋白或有机环化化合物结合类蛋白等；应用轴突导向模型证实，Ank2-440可与影响轴突导向的crmp 1、cofilin 1蛋白相互结合，引起其在导向侧和非导向侧的不对称分布。结论： CDK5可多重磷酸化Ank2-440，参与了轴突导向，引起p-Ank2-440在轴突生长锥导向侧局部增多的不对称分布；CDK5磷酸化Ank2-440通过影响其与crmp1和cofilin1的结合能力进而影响轴突导向。该研究为阐明Ank2-440在神经发育中的作用提供了新的理论基础和新的机制，进一步的研究可以为神经发育和神经退行性疾病提供一个新的治疗策略.