线虫精子细胞极性建立和细胞运动的分子调控机理研究

线虫精子细胞利用片状伪足爬行，运动过程与以Actin为细胞骨架的阿米巴运动行为一致。但其以精子主要蛋白(Major Sperm Protein, MSP)形成细胞骨架，提供了一个相对简单和独特的细胞运动研究体系。目前仅知磷酸化/去磷酸化调控了线虫精子细胞骨架的解聚收缩，但其具体的调控机制还未知。本研究将在利用生化和遗传学方法筛选出Rho和MAPK信号分子参与了精子细胞运动调控的基础上，结合细胞生物学和分子生物学的手段分析Rho和MAPK在线虫精子细胞极性建立、细胞骨架解聚收缩以及细胞运动过程中的调控机理；分析Rho和MAPK的上游调控因子和下游效应分子及他们的活性调节机制，进而阐明Rho和MAPK信号通路在线虫精子细胞中的网络调控过程；利用免疫和透射电镜揭示信号分子的分布与精子细胞骨架的细微结构。预期研究结果将对线虫精子细胞运动调控机制的阐明和动植物寄生线虫的控制提供基础知识和新的策略。

线虫精子细胞是研究细胞运动的一个独特且相对简单的研究体系。线虫精子的运动不同于其它高等动物精子的鞭毛游动，而是一种以精子主要蛋白(MSP)形成细胞骨架驱动的阿米巴运动。精子必须经过活化才能爬行，其活化过程包括两个典型的形态变化，在胞外信号的诱导下，圆形精子伸展伪足，胞体的膜器（membranous organelle，MO）与细胞膜融合。这两者变化的分子机制还不十分清楚。本项目主要以线虫精子为研究材料，通过生化和细胞学的方法筛选并鉴定出了调控精子细胞活化的调控因子Rac1和ERK，并通过改变这些因子来研究它们如何影响精子活化，获得出如下进展：1）利用线虫精子的无细胞体系，通过pull-down和Western blot检测到了小G蛋白Rac1，免疫荧光实验表明Rac1及其上游调控因子GAP都呈点状分布于活化的线虫精子伪足中，且Rac1的抑制剂Simvastatin能够阻断细胞形成伪足。同时我们还检测到了另一种小G蛋白Rab3A，其分布也定位在伪足和细胞质膜中。2）在分析线虫精子细胞提取物体外重演细胞骨架聚合过程中，通过Western Blotting发现，ERK1/2随着这一过程发生了磷酸化作用。免疫荧光表明p-ERK1/2存在于活化的线虫精子的伪足中，并且在活化精子的提取物体外重组生成的fiber中也有p-ERK1/2的分布。ERK1/2激酶的抑制剂和它的上游因子MEK的抑制剂都能阻断精子细胞伪足的生成。另外发现MAPK的另一成员JNK/p38单独就能引起C.elegans 的精子活化。3）研究发现ERK1/2的磷酸化对细胞器MO与细胞膜的融合起了促进作用，而Rac1抑制了这一融合过程。4）利用精子的无细胞体系细胞骨架重构分析发现Rac1和ERK1/2抑制剂处理后酪氨酸磷酸化水平都得到了提高，其细胞骨架的聚合速度也提高两倍以上，表明细胞骨架的聚合速度对精子细胞微丝（spike）到伪足的转化过程发挥了重要的作用。5）经过Rac1抑制剂Simvastatin处理过的精子的无细胞提取物的细胞骨架聚合体系中ERK1/2的磷酸化水平提高了两倍以上，表明了Rac1在线虫精子细胞中负调节ERK1/2的磷酸化水平。通过本项目的实施阐明了线虫精子活化过程中的Rac1和ERK1/2的分子调控过程，为下一步线虫精子细胞运动及其他阿米巴运动机制的研究提供了坚实的基础。