用于膜蛋白质组样品高通量预处理的串级膜接口与平行酶反应器的集成化方法研究

本项目针对传统表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）辅助溶解膜蛋白质组样品预处理方法存在的瓶颈问题，拟通过发展基于有机溶剂与离子液体混合溶剂体系辅助膜蛋白质高温变性、还原的方法,实现SDS与膜蛋白质的预分离；通过制备串级中空醋酸纤维膜接口，依次实现膜蛋白质溶剂中SDS的去除，以及缓冲液浓度和pH值的调节；采用亲水性功能单体和交联剂，通过原位聚合的方式在毛细管内制备低残留的基质材料，并通过固载胰蛋白酶和胃蛋白酶，实现膜蛋白质的平行在线酶解；在此基础上通过将上述部件整合，构建膜蛋白质集成化预处理系统，实现膜蛋白质的高通量和高回收率处理；通过与高分辨、高峰容量的多维液相色谱-质谱系统偶联，实现膜蛋白质组的高效分析。本项目发展的膜蛋白质集成化预处理方法，可以实现从膜蛋白质溶解到酶解的一体化操作，弥补传统膜蛋白质预处理方法存在的诸多问题。研究成果有望为实现规模化的膜蛋白质组分析提供重要技术支撑。

经过的三年研究，取得了成果如下：针对SDS与膜蛋白质分离后，膜蛋白质容易聚集的问题，发展了一种基于新型C12Im-Cl离子液体的膜蛋白质増溶溶剂体系，该溶剂不仅具有膜蛋白质溶解能力强，而且对蛋白酶的抑制不明显等优点，将其应用于鼠脑膜蛋白质的分析，与传统SDS方法相比，整合膜蛋白质的鉴定数量提高40%；研制了串级膜接口，并用于SDS、有机溶剂等对蛋白质酶解干扰小分子的去除，研究结果表明，膜接口的溶剂置换效率可达95%以上，且蛋白质回收率为94%±1.3%（n=3)；制备了两种新型的亲水性固定化酶反应器，以标准蛋白质混合物进行评价，蛋白质的酶解动态范围可达4个数量级，与其它非亲水固定化酶反应器比较，肽段的鉴定数目得到显著提高。此外，在此基础上，还构建集成化膜蛋白质样品预处理系统，以含有10%SDS的转铁蛋白质为样品考察该系统的性能，结果表明，与不处理样品相比，采用该系统处理后，转铁蛋白质得到了较好的检测，且蛋白质序列覆盖率超过60%。将该系统应用于鼠脑蛋白质的分析，不仅样品处理时间由传统FASP方法的1.5-2天缩短至6分钟，而且蛋白质的鉴定数目提高了10%以上。此外，还发展了基于双相柱的集成化膜蛋白质预处理系统，该方法不仅可将传统样品预处理时间缩短75%，而且膜蛋白质样品预处理量可降低至50 ng，提高了微量膜蛋白质的鉴定能力；将发展的串级膜接口与平行固定化酶反应器集成化样品预处理系统应用于人肝癌高低转移细胞株差异样品的分析，共发现了18种差异膜蛋白，其中10种膜蛋白上调，8种膜蛋白质下调，为揭示肝癌的转移提供了基础数据；在项目执行期间，发表SCI论文6篇，申请发明专利3项，培养研究生3名，其中已毕业1人。