纤维素酶系耐酸、耐热定向进化及其与纤维素稀酸预处理的耦合机制研究

纤维素酶系是生物法降解木质纤维素类物质的关键酶。但是现有纤维素酶系还存在酶活性低、稳定性差、适应性不强等问题，不能与酸预处理相耦合。所以，应提高纤维素酶系的适应能力和活性。那么，对纤维素酶进行定向进化改造将能实现纤维素类物质生物降解与预处理的耦合，将提高纤维素的降解效率。但目前仅对内切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶进行了单一酶组分和可溶性纤维素基质降解的定向进化研究，却没有对整个纤维素酶系和不可溶性基质降解进行定向进化研究。本项目分别把三种纤维素酶组分进行随机突变，并分别连接到原核表达载体上，转化至大肠杆菌中表达。并在含不溶性微晶纤维素的固体培养基上进行最佳纤维素组合酶系筛选。从而真正获得能适应耐酸、耐热前处理的、能降解不溶性微晶纤维素的、高活性的组合酶系，并能够在大肠杆菌中异源表达。

本项目首先从里氏木霉中克隆获得内切葡聚糖酶EG2和β-葡聚糖苷酶BGL1的cDNA，采用RAISE法对里氏木霉的内切葡聚糖酶EG2和β-葡聚糖苷酶BGL1进行了随机突变，并连接到pET-22b载体上，转化至大肠杆菌Ecoli BL21(DE3)中进行表达，并进行了初步突变的筛选，结果不理想。随机突变和筛选工作遇到很大困难，几乎没有任何进展。课题组及时调整方向采用生物信息学方法计算定点突变和酶活性验证的策略来提高酶的耐热性和耐酸性。课题组从EG2成熟肽上选取了55个关键位点来计算该位点突变后的稳定性。从BGL1成熟肽上选取了75个关键位点来计算该位点突变后的稳定性。经过8个月和大量的计算，课题组根据计算结果，按照从高到低的原则，在EG2上选到6个关键的蛋白质位点，这些位点的突变可能会大幅提高EG2耐酸和耐热的稳定性。在BGL1上选到6个关键的蛋白质位点，这些位点的突变可能会大幅提高BGL1耐酸和耐热的稳定性。目前，课题组正通过定点突变技术试图获得这12个突变子，之后将进行相关酶活性和酶适应性验证工作。