靶向EGFR家族的中等亲和力CAR-T治疗胆道恶性肿瘤的探索研究

Chimeric antigen receptor-modified T cells (CAR-T) can kill tumor cells in a MHC-independent manner. It has achieved inspiring achievement in the clinical treatment of B-cell leukemia, but its efficacy for solid tumors remains to be improved. One important reason is the lack of suitable targets: the existence of highly heterogeneous within solid tumors leads to lack of universal cell surface target suitable for CAR-T cells; utilization of tumor-associated antigens may cause severe side effects. Therefore, to build CAR system having the capacity to bind a universal tumor target with a moderate affinity is an important direction in the effort to use CAR-T cells in the treatment of solid tumors. In the previous study, we found that a polypeptide encoded by a HER2 intron (Herin) has a broad spectrum of capacity to bind multiple members of EGFR family, and the binding affinity is moderate. So Herin might be an ideal element in the CAR system for solid tumors. In the present study, we intend to use the peptide to build a novel CAR-T system and survey the killing mechanism, killing activity and side effects. Furthermore, its clinical value in treating for malignant tumor of biliary tract will be evaluated.

嵌合抗原受体修饰的T细胞（T cell engineered with Chimeric Antigen Receptor, CAR-T）能通过非MHC依赖性方式杀伤肿瘤细胞，在B细胞白血病的临床治疗中取得理想疗效，但对实体瘤的疗效仍有待提高。一个重要原因是合适靶点的匮乏：实体瘤细胞存在高度异质性，缺乏肿瘤广谱表达的细胞表面靶点；针对肿瘤相关抗原的CAR-T细胞可能造成严重的毒副作用。因而，构建能广谱识别肿瘤细胞且具有中等亲和力的CAR是利用CAR-T治疗实体瘤的一个重要方向。在前期研究中，我们发现一个编码自HER2内含子的多肽（herin）具有广谱结合EGFR家族多个成员的特性，且亲和力居中等水平，是个理想的CAR基因抗原结合元件。在本研究，我们拟研究利用该肽段构建的CAR-T细胞的杀伤谱、杀伤机制、杀伤活性、毒副作用，并探讨它在胆道恶性肿瘤治疗中的应用价值。

CAR-T细胞治疗实体瘤疗效仍欠佳，关键原因是：实体瘤细胞间差异大，单靶点CAR-T难以清除异质性肿瘤细胞；实体瘤细胞与正常组织细胞差异小，高亲和力CAR-T细胞可能引发严重的毒副作用。因而，构建识别范围更广谱且亲和力中等的CAR-T细胞是提高CAR-T细胞治疗实体瘤疗效的重要方向。.在本研究中，我们应用编码自HER2内含子的多肽（Herin）作为CAR基因识别抗原的元件，基于PiggyBac转座子非病毒载体系统，构建识别EGFR家族多个成员且亲和力中等的CAR-T细胞（即herinCAR），测试其杀伤异质性肿瘤细胞的活性与安全性。为达成目的，我们分别做以下改进：1. 优化Herin的编码序列，提高CAR基因的表达水平；2. 调整CAR基因的跨膜区，提高CAR结构的信号传递效率；3. 增加IL2R胞内信号区，增强CAR-T细胞的增殖与存活能力。.我们选用靶向EGFR的中等亲和力抗体构建CAR-T，表明其能高效杀伤EGFR高表达肿瘤细胞，而不损伤EGFR低表达正常细胞。同时，我们发现识别不同表位的抗体可导致不同抗原检出率，因而比较了识别同一MSLN抗原不同表位的CAR-T细胞的治疗效果，表明识别近膜端表位的CAR-T细胞相较于识别远膜端表位的CAR-T细胞具有更强的杀伤活性。另外，我们基于以上原理，测试了GPC3、MSLN抗原特异性CAR-T对肝细胞癌、胆管细胞癌、胰腺癌等的疗效与安全性。.以上结果均表明，基于中等亲和力抗体构建的CAR-T细胞能特异杀伤特定抗原高表达肿瘤细胞，而避免对抗原弱表达正常组织细胞的误攻击，具有良好的安全性与有效性。共发表标注课题编号的SCI论文8篇，中文核心期刊论文1篇；授权中国发明专利4项，培养研究生3名。