基于microRNA调控的溶瘤腺病毒载体系统研究

靶向性不足的问题困扰着溶瘤腺病毒的实际应用。我们实验室在国际上较早开展溶瘤腺病毒的研究，通过多种调控方式提高溶瘤腺病毒的靶向性，开发出一系列溶瘤腺病毒治疗系统。但肿瘤发生机制复杂，现有调控方式的又各存缺陷，亟需引入新的调控机制来提高溶瘤腺病毒的靶向性。microRNA可通过与mRNA 3'非翻译区内的靶序列结合，抑制蛋白的合成。而一些在正常组织细胞内表达的microRNA常在肿瘤细胞中异常下调。因而，我们利用肿瘤细胞特异下调的microRNA调控腺病毒增殖必需基因的表达，开展基于microRNA调控的溶瘤腺病毒的研究，已取得初步研究成果，并申请了国家发明专利。拟通过本课题的研究，探明microRNA作为肿瘤靶向性调控开关所涉及的相关机制，研究在这新调控方式的作用下溶瘤腺病毒的肿瘤靶向特性，溶瘤效果与毒副作用，并初步探索该调控机制与其它靶向性调控机制的兼容问题。

溶瘤腺病毒既可介导外源基因高效表达，其本身又具有裂解肿瘤细胞的能力，因而是恶性肿瘤靶向治疗的理想载体。然而，如何在不削弱溶瘤腺病毒自身抗癌活性的前提下，提高其对肿瘤细胞的靶向性，降低其对正常细胞（尤其是正常肝细胞）的毒性，目前仍是肿瘤基因-病毒治疗领域的一大难题。在本研究中，我们根据肝癌细胞株及原代肝癌组织中microRNA（如let-7、miR-199a/b-3p）表达显著下调的特点，利用细胞内源性microRNA（如let-7、miR-199a/b-3p）调控腺病毒增殖必需基因E1A的表达，继而调控病毒的增殖特性，建立基于肝癌特异性下调microRNA的溶瘤腺病毒调控策略。研究表明，调控后的溶瘤腺病毒对let-7或miR-199a/b-3p表达下调的肝癌细胞的体内外杀伤作用与野生型腺病毒无显著差异，而对正常肝细胞的毒性被显著降低。在此基础上，我们以5/11嵌合纤毛代替5型纤毛，构建基于let-7调控的纤毛嵌合型溶瘤腺病毒。该病毒相对于5型腺病毒对肝癌干细胞的感染效率显著提高，并有效抑制肝癌干细胞的生长；而对let-7中等水平表达的间充质干细胞，虽然病毒对其感染效率较高，但病毒在其内基本不增殖，对其细胞活力基本无影响。从而在提高对肿瘤干细胞感染与杀伤作用的基础上，有效避免对正常干细胞的毒性。另一方面，我们将基于microRNA的调控策略引入重组腺病毒的生产中，利用腺病毒包装细胞株HEK293细胞高水平表达的microRNA—miR-15a调控外源基因的表达，使外源基因基本不在293细胞内表达，避免其对病毒包装效率的副作用，从而有效提高重组病毒的滴度。通过以上方面的研究，共发表SCI论文2篇，待发表SCI论文1篇（小修），发表中文核心期刊论文1篇；获得中国发明专利授权1项，国际PCT 1项，申请中国发明专利5项；培养博士研究生2名；入选第二军医大学“优秀青年学者”人才培养计划。课题的实施，为后续研究打下良好的基础。