葡糖胺N位点硫酸化修饰在硫酸乙酰肝素生物合成中编码机制的研究

Heparan sulfate (HS) is a glycan that play wide ranges of essential physiological functions. HS contsists of a disaccharide repeating unit of glucuronic acid (GlcA) or iduronic acid (IdoA) and glucosamine, each capable of carrying sulfo groups. The position of the sulfo group on the saccharide residue and the location of IdoA residues determine the activity of HS. Although the process is not driven by a template, the data in our lab as well as from others suggest that the biosynthesis of HS is under tight regulation in the cells. Our hypothesized that HS biosynthesis is governed by a coding step and decoding step during the regulation of chemical structure and the biological functions. The distribution of N-sulfo groups governed by the four N-Deacetylase/N-Sulfotransferase (NDST) isforms are the code, and would be decoding by the other modification enzymes. The success of this project will not only determine the various catalytic modes of different NDST isoforms, get the molecular mechanism of this difference, but also uncover a fundamental biosynthetic mechanism of sulfated polysaccharides. The information will also improve and enhance the enzymatic method to prepare a polysaccharide-based anticoagulant drug, heparin.

硫酸乙酰肝素（HS）糖链结构影响蛋白聚糖的生理功能和病理活性。申请人推断机体细胞通过编码和解码的两个过程实现对HS化学结构的严格调控，生物活性的调节,相关研究结论及申请人前期工作皆支持这一科学假设。四种N-脱乙酰基酶/N-硫酸基转移酶（NDST）同工酶决定葡糖胺N位点硫酸根分布是其中的编码过程，而产生的"密码"通过后续修饰酶的辨析（即解码），确定糖链异构化和硫酸化的结构细节。我们推断人体四种NDST同工酶具有不同的底物识别和催化模型，即不同的编码方式。本项目计划利用蛋白重组技术和酶法寡糖合成技术，实现4种NDST同工酶分别硫酸化修饰5种结构确定的模式底物，解析产物结构，揭示NDST各同工酶的催化模型及其对糖链生物活性的影响，从而证明葡糖胺N位点硫酸化修饰的编码作用。揭示HS为代表的硫酸化多糖合成调控的基本机理，理论意义重要，而且相关结论可直接应用于HS类似物酶法合成，潜在应用价值明显。

由于模式底物的缺乏和人源酶分子重组表达的困难，细胞通过酶特异性的催化模型实现对蛋白聚糖硫酸化多糖侧链化学结构的调节的猜想一直缺少直接的证据支撑。硫酸乙酰肝素（HS）作为结构、功能、生物合成研究最为透彻的一类硫酸化多糖，使 HS 成为深入研究该重要科学问题的理想的模式对象。近年来，酶法体外合成 HS 类似寡糖技术得到突破。为有效的制备所需的模式寡糖分子，项目组首先对包括HS在内的糖胺聚糖制备相关酶的酶学性质，受体与单糖供体的底物适应性及催化机理等方面开展了理论研究，拓展了可以制备的糖链种类，也为该类酶分子的蛋白质工程改造提供理论支持。在寡糖合成体系优化的基础上，完成了研究所需的10条模式寡糖底物的合成。通过解析模式底物与重组NDST2-4反应产物的结构，基本确定了人体细胞内N-脱乙酰基酶/N-硫酸基转移酶同工酶（NDST1-4）的催化活性的存在差异。组织表达最为广泛，各发育阶段皆有表达的NDST1具有完成的双催化活性，即能够独立完成HS骨架中GlcNAc残基转变成为GlcNS残基，并为后续的糖链修饰酶提供必要的底物结构信息。该酶应该是人体细胞合成HS这一必需糖胺聚糖的主要酶分子。而NDST3和4只具有其中一种活性，NDST3或4一种酶分子并不能有效的承担硫酸乙酰肝素合成关键的“第一步硫酸化修饰”的任务；单独由NDST3或4修饰的肝素骨架，由于GlcNS残基的缺失，并不能作为后续异构酶和2位、6位和3位硫酸基转移酶的底物，最终导致糖链并不具有HS或肝素的生理活性。这一结论与已有的NDST体内研究结论相符。项目结论初步证明编码步骤的确存在，揭示编码产生的分子机制及其与生物活性的关系，实现了项目设定的最重要的目标，而且相关结论为HS糖链酶法合成技术的改进有一定的理论意义。.