miRNA与水稻雄配子发育关系研究

从水稻分离的花粉中提取RNA，利用small RNA高通量测序技术和基因表达谱芯片杂交技术揭示水稻花粉存在的miRNA及其靶基因；通过RT-PCR，Northern杂交,原位杂交等技术研究miRNA在植物雄配子体不同发育时期的表达特征；在花粉离体成熟与萌发培养以及转基因基础上，通过miRNA活性抑制或超表达技术研究miRNA与其靶基因的表达动态以及花粉表型关系，从而回答miRNA是否与植物雄配子体发育直接相关的问题。

本项目研究旨在揭示miRNAs是否普遍存在于植物配子体以及miRNAs是否与雄配子体发育直接相关的问题。通过从水稻单核小孢子、二核花粉及三核花粉中分离总RNA、small RNA做全基因组基因表达谱芯片杂交和高通量测序，结合生物信息学及实验验证等手段鉴定与分析花粉发育相关miRNA及其与花粉表达基因之间的关系，主要获得了如下结果：.1.成功创建了的“small RNA高通量测序数据综合分析”平台。该平台“设计简单、效率高和功能强、扩展性好、统计结果灵活多样”，miRNA预测的准确率较高(达75%)。.2.利用我们建立的技术平台，鉴定出了51种已知的miRNA和225种新miRNA，其中多数(58%)是花粉发育特异或优势表达。花粉发育表达的miRNA从单核小孢子(Pa)到二核花粉(Pb)再到三核花粉(Pc)阶段，表达总体趋势上调。 .3.水稻花粉特异表达三个Argonaute 基因（AGO12，AGO13和AGO17），表达包括RDR家族在内的其他sRNA途径相关基因，表明水稻花粉发育拥有自身特异的small RNA途径。.4.水稻发育花粉拥有特殊的基因表达模式。发育花粉表达13663个基因，无论从Pa到Pb还是Pb到三核花粉Pc阶段，下调的基因都多于上调的基因。花粉特异表达2925个基因及107个转录因子，这些基因总体上也随发育进程下调。.5.约1/3的水稻花粉表达的蛋白编码基因(4239个基因)受miRNA的调控，以表达抑制为主。.6.靶基因的GO富集分析结果显示，miRNA通过参与核酸、蛋白质、多糖、脂类代谢及信号转导等许多重要过程调控水稻雄配子体的发育进程。.7.建立了简便快速、准确检测miRNA等small RNA的液相Northern 杂交技术。通过荧光探针的液相杂交，仅需3-4小时即可检测出1个碱基差异的小分子RNA,并可以定量和同时检测多种小分子RNA。.结论：植物雄配子体中存在大量的miRNA等小分子RNA。miRNA对水稻雄配子体发育的调控是通过特有的小RNA途径及其他机制调控约1/3的蛋白编码基因的表达来实现的。