植物不同启动子与雄配子体in-miRNA的表达关系

A large number of microRNAs(miRNAs)have been found in multi-cellular organisms and have a profound impact on the physiological and biochemical metabolism, growth, development, and stress response, etc. Like human and other animals, many of plant miRNAs locate in the intronic regions of protein-coding genes, known as intronic miRNAs(in-miRNA).In biogenesis, it is generally accepted that the in-miRNAs generate along with transcription and processing of host gene. However, our investigation on the expression of in-miRNAs and host genes in Oryza sativa indicates that the generation of some in-miRNAs obviously cannot be explained by 'accompanying transcription', and whereas is likely regulated by the upstream promoter-like sequences close to in-miRNAs. To prove the assumption, we will clone the closely neighboring promoter-like sequences of in-miRNAs and the promoters of their host genes, dissect the functional characteristics of these cloned sequences through bioinformatics, deletion, mutation, transgenic technology and other means, and comparatively analyze the expression of in-miRNAs and host genes under the control of both promoters, leading to reveal the role and status of the closely neighboring promoters of in-miRNAs and the promoters of host genes in the expressions of in-miRNAs.

microRNA（miRNA）在多细胞生物体中大量存在，对生物的生理生化代谢、生长发育及逆境响应有着非常深刻的影响。与人类及其他动物一样,植物的miRNA中有许多位于蛋白编码基因的内含子区，即内含子miRNA(in-miRNA)。通常认为，in-miRNA是随宿主基因的转录本pre-mRNA的剪切加工过程产生的。但是，我们在分析水稻miRNA及其宿主基因表达关系时发现，有些in-miRNA的产生显然不能用"伴随转录"来解释，而很可能是由其自身上游的近邻启动子调控的。 为证明该假设，本项目研究拟克隆in-miRNA近邻启动子序列及宿主基因的启动子序列，进而借助生物信息学技术、基因的片段缺失与突变、转基因技术等手段解剖克隆序列的功能特征，结合分析两种启动子驱动下的in-miRNA的表达量，从而揭示in-miRNA近邻启动子序列及宿主基因启动子在in-miRNA表达调控中的作用与地位。

本项目研究旨在解析宿主基因启动子及 in-miRNA（位于蛋白编码基因内含子区域的microRNA）上游近邻调控序列与in-miRNA 表达的关系。通过克隆in-miRNA 近邻启动子序列及其宿主基因的启动子，并结合分析两种启动子驱动下的in-miRNA 的表达量，进而借助生物信息学和实验验证等手段分析in-miRNA 近邻启动子序列及其宿主基因启动子在in-miRNA 表达调控中的作用与地位，主要获得了如下结果：.1. 通过生物信息学方法发现水稻总miRNAs中有超过1/4为in-miRNAs，且在结构、功能、起源与发生等方面都具有丰富的多样性。同时，对水稻in-miRNAs与宿主基因的表达关系分析发现in-miRNA可能具有自身的启动子，使得in-miRNA的表达与宿主基因的表达不一致。因此，我们提出了两个模型：水稻in-miRNAs的负反馈调控和独立转录。.2. 对水稻in-miR3029、in-miR3028与in-miR3026的近邻启动子序列进行序列分析和启动功能实验发现其具有启动子功能。.3. 对这三个in-miRNA近邻启动子序列及其宿主基因启动子进行调控元件分析发现二者既存在相同调控元件，又存在差异调控元件。对启动子不同片段进行启动活性分析发现宿主基因启动子的活性显著大于in-miRNA近邻启动子序列活性。.4. in-miR3029宿主基因RNAi干扰和过表达植株的in-miRNA定量结果和in-miRNA与宿主基因的表达动态结果均表明in-miR3029的表达不仅受到其宿主基因的影响，还受到其自身启动子的影响。.5. 对水稻in-miR3029的5’UTR-like的结构与功能解析结果发现in-miR3029的表达还受到其二级结构上茎环结构的调控。.6. 通过人工miRNA干扰水稻osAGO17基因结果发现大部分水稻花粉的败育，因此推测osAGO17可能与水稻花粉的发育有关。.7. 建立了一套快速准确的动植物miRNA 的液相杂交-固相检测方法。通过把液相杂交技术和固相检测技术相结合，不仅大大提高了miRNA检测的灵敏性和准确性，同时可以检测一个碱基的差异。另外，此方法整个过程也只要9小时就能完成，同时还可以进行miRNA的定量分析。