副粘病毒HN蛋白功能性关键氨基酸定位与促细胞融合机制研究

副粘病毒是人类（特别是婴幼儿和儿童）及动物的重要致病病毒。病毒的包膜上镶嵌着两种糖蛋白，即血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合蛋白(F)。HN具有受体识别、神经氨酸酶和促细胞融合活性；F有细胞融合活性，但需要与同源性HN共表达才能完成。本课题拟在原有研究的基础上，以人副流感病毒（hPIV）和新城疫病毒(NDV)为模型，对HN分子上的糖基化位点、促细胞融合区域、唾液酸结合位点中的保守aa，以及各功能区域外的保守aa,采用基因定点突变、基因重组等方法得到各种突变体，然后于BHK21细胞中表达，检测受体识别活性、神经氨酸酶活性和促细胞融合活性，确定功能性关键氨基酸的位置；并用反向遗传技术在病毒水平检测关键氨基酸的功能；对于影响促细胞融合活性的关键氨基酸，采用表面等离子共振（SPR）技术分析突变的HN与F蛋白的相互作用。旨在阐明这些关键位点在HN蛋白生物学活性中的作用，并探讨其影响细胞融合的分子机制。

利用基因定点突变和基因重组的方法，在NDV和hPIV-3 HN和F蛋白的功能区域内外选择保守的65个氨基酸，共构建60个突变体，然后对各突变株蛋白的功能进行检测。在NDV和hPIV-3 HN和F蛋白分子上确定了关键氨基酸的位置和功能，阐明了两种病毒的细胞融合机制。.对NDV来说，HN蛋白的4个糖基化位点、HR区域内6个保守氨基酸位点和功能区域外的9个氨基酸位点突变后，发现N481、E401、G402、V469、Y526、T527位点对HN蛋白的促细胞融合活性有着重要影响，功能区域外的R403、Y470和 T528位点突变后抑制了NDV HN蛋白的表达，F蛋白N257D-N258D-Q259E、G271D-N272D 和 Q279E-Q281E联合突变体的蛋白表达率和细胞融合活性几乎为零，而Q204和Q205同时突变或者G244D和N245D同时突变能促进其细胞融合活性。对hPIV-3来说，HN蛋白的3个糖基化位点、9个受体结合活性和神经氨酸酶活性位点，6个六肽区保守氨基酸位点（除S257外）和9个羧基端保守三肽区位点对HN蛋白的促细胞融合活性有着不同程度的影响，其中R502、R253、C256和T532对HN蛋白的促细胞融合功能影响相对较大，是各活性区域的关键氨基酸。F蛋白的D143A-E145A、K263A-R265A、D268A-D270A和R475A-R476A突变体的促细胞融合活性有不同程度的降低但却保留着占野毒株95%以上的蛋白表达效率，而E223Q-K224A检测不到其蛋白表达率。最后，比较这两种病毒HN蛋白突变位点的功能，发现对于NDV，HN蛋白与F蛋白相互作用会受到HN蛋白受体活性的影响，而hPIV-3 HN蛋白突变株与F蛋白相互作用不会受到任何HN蛋白活性（包括受体结合活性）的影响。