血满草多糖的结构解析、化学修饰及免疫活性研究

Sambucus adnata Wall. has been used as traditional medicine, in China. It is minly used for the treatment of acute/chronic nephritis, arthritis pain, fracture and so on. Polysaccharide has a wide range of biological activity also. But no reports on isolation, purification, structure analysis and bioactivity of the polysaccharides from Sambucus adnata Wall.. In this study, with Sambucus adnata Wall. as plant material, the polysaccharides will be extracted and purified using hot water and chromatography. The primary and spatial conformation features of polysaccharide will be elucidated by a combination of HPLC, periodate oxidation and the degradation of Smith, methylation and GC/MS, IR spectra, NMR spectroscopy, Congo red test, XRD、CD、AFM、SEM. And then the polysaccharide derivatives will be obtained using sulfation, carboxymethylation and selenylation methods. The immunomodulatary effect of the polysaccharide will be designed to investigate in vitro using cell and molecular biology technologies, such as MTT、ELISA, flow ctometry, PCR fluorescent quantitative. This investigation focuses on spleen lymphocyte, mononuclear macrophage and dendritic cells, in order to illustrate the possible underlying mechanism. Our research may provide critical basis for developing Sambucus adnata Wall..

血满草是我国传统中药，主要用于治疗急慢性肾炎、风湿疼痛、骨折等症，而多糖类化合物也被证实具有广泛的生物学活性。然而，目前关于血满草多糖的研究未见报道。本项目以血满草茎和叶为研究对象，运用热水浸提和层析技术提取、纯化血满草多糖。综合运用HPLC、高碘酸氧化和Smith降解、甲基化和GC-MS、IR、NMR、刚果红实验、XRD、CD、AFM、SEM等分析技术，表征其一级结构和空间构象；对血满草多糖进行硫酸化、羧甲基化和硒化修饰改性，制备不同结构类型的血满草多糖衍生物。运用MTT、ELISA、流式细胞术、荧光定量PCR等细胞和分子生物学技术，以小鼠脾淋巴细胞、单核巨噬细胞和树突状细胞为靶细胞，从体外水平研究血满草多糖及其衍生物的免疫调节活性，并初步研究其免疫调节活性的作用机制。为血满草的开发利用提供依据。

血满草是我国传统中药，主要用于治疗急慢性肾炎、风湿疼痛、骨折等症，而多糖类化合物也被证实具有广泛的生物学活性。目前关于血满草多糖的结构与活性研究未见报道，为了更好的开发利用这一特色植物资源，本项目以血满草为研究对象，运用热水浸提技术，通过单因素和响应面设计优化了血满草多糖的最佳提取工艺。采用Sevage法脱蛋白、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephacryl S-300凝胶层析技术，制备得到糖含量高、均一性好的中性多糖SPW-2和酸性多糖SPS-1。综合分析SPW-2和SPS-1的单糖组成、甲基化、IR、NMR等结果，解析了SPW-2和SPS-1的结构，并通过CD、AFM、SEM和TEM等分析技术初步表征了SPS-1的空间构象。. 免疫活性结果显示，SPW-2可促进RAW264.7细胞的增殖，诱导NO、IL-1β、IL-6以及TNF-α的分泌及mRNA表达水平的升高，明确了SPW-2的免疫活性。以SPS-1为原料，制备了SPS-1的硫酸化、羧甲基化和硒化修饰衍生物。SPS-1及其衍生物可促进RAW264.7细胞增殖，且所选浓度对RAW264.7细胞均没有细胞毒性；SSPS-1的免疫活性较SPS-1有显著性提高，而CSPS-1的活性则有显著性降低，SeSPS-1的活性与SPS-1相比变化不大。SPS-1和SSPS-1能显著提高巨噬细胞的吞噬活性。采用WB技术分析了SPS-1和SSPS-1对RAW264.7细胞内信号蛋白的表达情况，结果显示SPS-1和SSPS-1能够与RAW 264.7巨噬细胞上的TLR2受体结合，并通过MARK和NF-κB信号通路激活RAW 264.7细胞的免疫活性。SPS-1和SSPS-1可上调DCs细胞表面标志物CD80和CD86表达，降低DCs对FITC-dextran的吞噬能力，说明SPS-1和SSPS-1可促进DCs的成熟，并通过MARK和NF-κB信号通路激活DCs的免疫活性。. 综上所述，项目组优化了血满草多糖的提取、纯化工艺，制备了纯度较高、均一性好的多糖组分，解析了多糖的结构信息，明确了血满草多糖的免疫活性及作用机制，为血满草多糖的深入研究及实际应用奠定基础。