低水平牙龈卟啉单胞菌内毒素血症在动脉粥样硬化中的作用

牙周炎发病过程中，牙龈卟啉单胞菌（Pg）等细菌的内毒素可以进入血液，形成低水平的内毒素血症，这种低水平的内毒素血症是否影响血管壁，并促进动脉粥样硬化（AS）尚无报道。Pg内毒素与低密度脂蛋白（LDL）在细胞中激活相似的信号通路，共同作用时，可能发挥比各自单独作用更强的血管损伤效应，因此我们推测：牙周炎导致的低水平内毒素血症可能促进AS进展。本项目拟应用微量渗透压泵向大鼠腹腔注射Pg内毒素和LDL，模拟低水平内毒素血症和高脂血症；从血管壁脂质代谢、炎症因子和Toll样受体的表达、NF-κB信号通路激活等多个角度，分析低水平Pg内毒素血症对血管壁的损伤及其机制；应用NF-κB特异性阻断剂，研究其能否阻断血管壁的损伤；通过动物实验，体内研究低水平Pg-LPS对巨噬细胞吞噬脂质过程的影响，进一步分析低水平Pg内毒素促进血管损伤的分子学机制。本项目将为牙周病与全身疾病的相关性提供直接的实验依据。

牙周炎发病过程中，牙龈卟啉单胞菌（Porphytomonas gingivalis, Pg）等细菌的内毒素可以进入血液，形成低水平的内毒素血症，这种低水平的内毒素血症持续影响血管内皮以及血管壁的脂质代谢。.本项目中，应用微量渗透压泵在大鼠腹腔缓慢释放Pg内毒素（Pg-LPS）（5 mg/kg体重），每日腹腔内注射低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）（5 mg/kg体重），从而建立长时间低水平内毒素血症和高脂血症模型；利用免疫组织化学技术观察血管壁中LDL的沉积，腹腔注射LDL后，血管壁中脂质氧化产物氧化低密度脂蛋白（oxidized LDL, oxLDL）的产生，发现Pg-LPS血症促进血管壁脂质沉积；通过血管免疫组织化学染色，发现LDL注射和Pg-LPS缓释放均可导致血管壁促炎细胞因子如单核细胞趋化因子（monocyte chemotactic protein-1, MCP-1）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和细胞间粘附因子（intracellular adhesion molecule-1, ICAM-1）等上调，二者具有协同增强作用；通过血管壁免疫组织化学，实验发现低水平内毒素血症促进血管壁TOLL样受体-2（Toll like receptor-2，TLR-2）和髓系细胞触发受体-1（triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1）的表达；应用TLR-NF-κB信号通路的阻断剂LP-17多肽腹腔注射，发现LP-17多肽可以减少血管壁的损伤。.在为进一步研究LP-17多肽的作用，后续研究中通过LP-17多肽腹腔提前注射，再腹腔注射oxLDL（5mg/kg体重）和Pg-LPS（5mg/kg体重），收集腹腔液行ELISA检测TNF-α和MCP-1的水平，结果显示LP-17可以阻断oxLDL和Pg-LPS对腹腔细胞的炎性刺激作用；通过收集腹腔细胞行实时定量PCR显示，LP-17多肽阻断了TNF-α和MCP-1的转录。.为进一步研究LP-17多肽阻断剂作用的机制，在本研究中构建了TREM-1短发夹RNA（short haipin RNA，shRNA），通过慢病毒感染RAW264.7巨噬细胞，通过流式细胞技术、免疫印迹和实时荧光