纳米去甲斑蝥素联合mF4-31C1/sorafenib靶向抗VEGF-C、-D介导的结肠腺癌淋巴管生成及其相关机制研究

本研究旨在项目组前期开展淋巴管内皮细胞、结肠腺癌细胞体外模拟和裸鼠种植形成淋巴管生成预实验的基础上，建立裸鼠结肠腺癌皮下移植和原位种植肿瘤淋巴管生成动物模型，通过MTT法、流式细胞仪、淋巴管内皮细胞标记、免疫组织细胞化学、Western-blot、实时荧光定量聚合酶链反应（RTFQ-PCR）、相差荧光显微镜/电镜等技术，同时与慢病毒介导的VEGF-C、-D/VEGFR-3 siRNA靶向抗结肠腺癌细胞和裸鼠荷瘤淋巴管生成作对照，探讨纳米去甲斑蝥素联合mF4-31C1/sorafenib靶向拮抗VEGF-C、-D介导的结肠腺癌淋巴管生成及其相关形态学、靶基因、信号调控分子及作用机制，为结肠腺癌的综合治疗提供新的"抗淋巴管生成治疗"作用靶点和理论、实验依据。故具有重要的理论意义、科学价值和前瞻性临床应用前景。

目的 探讨纳米去甲斑蝥素（NCTD）联合mF4-31C1/sorafenib靶向拮抗VEGF-C、-D介导的结肠腺癌淋巴管生成。方法 通过人淋巴管内皮细胞（HLECs）、结肠腺癌LS174T/HT-29细胞培养，建立HLECs、结肠腺癌细胞和裸鼠皮下/原位移植瘤淋巴管生成模型，并与慢病毒介导VEGF-C、-D/VEGFR-3 siRNA靶向拮抗结肠腺癌细胞和裸鼠荷瘤淋巴管生成作对照，应用MTT法、凋亡侵袭迁移试验、淋巴管内皮细胞标记测定、免疫组化、Western-blot、RT-PCR、荧光显微镜/电镜，观察对VEGF-C、-D/VEGFR-3介导的HLECs、结肠腺癌增殖、凋亡、侵袭、迁移、淋巴管生成及其相关形态学、信号调控分子的影响。结果 ①NCTD/mF4-31C1抑制HLECs和结肠腺癌LS174T/HT-29细胞的增殖、迁移、浸润并诱导凋亡，下调VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3蛋白/mRNAs表达，通过阻断VEGF-C、-D/VEGFR-3信号通路抑制HLECs细胞和结肠腺癌细胞三维培养体外模拟淋巴管生成；②通过LYVE-1、D2-40、CK20测定，裸鼠结肠原位移植瘤淋巴管生成能更好反映结肠癌淋巴管生成特性；NCTD或联合mF4-31C1/ sorafenib抑制LYVE-1、D2-40、CK20和VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表达，亦通过阻断VEGF-C、-D/VEGFR-3信号通路抑制裸鼠结肠原位移植瘤生长和淋巴管生成，延长荷瘤裸鼠生存期；③通过VEGF-C、-D、VEGFR-3 siRNA慢病毒转染HT-29细胞并由此建立结肠腺癌裸鼠原位移植瘤模型，表明RNAi靶向沉默HT-29细胞和移植瘤VEGF-C，-D、VEGFR-3可明显抑制HT-29细胞增殖、迁徙，诱导凋亡，抑制裸鼠原位移植瘤生长和淋巴管生成，从而推论VEGF-C，-D/VEGFR-3是促进结肠腺癌淋巴管生成的信号通路和作用靶点。结论 NCTD或联合mF4-31C1/sorafenib靶向拮抗VEGF-C、-D/VEGFR-3介导的结肠腺癌淋巴管生成和肿瘤生长；NCTD或联合mF4-31C1/ sorafenib可能是针对结肠腺癌淋巴管生成的新的抗淋巴管生成治疗。