基于DNA甲基化调控γ珠蛋白生成探讨益髓生血颗粒治疗β地贫的分子机制

There has been 30 years to treat βthalassemia with Yisuishengxue granule.Previous research found that Yisuishengxue granule can promote gene expression of γglobin,and increase HbF.Evidence has found that γglobin gen express in fetal period and close after birth,and is replaced by βglobin gene.This process is closely related with DNA methylation.That is to say, in fetal period,gene regulating γglobin present DNA demethylation and promote gene expression;after birth,gene regulationg γglobin present DNA methylation and inhibit gene expression.Based on this fact,we propose the hypothesis:Yisuishengxue granule may have an influence on DNA methylation,and then promote γglobin gene expression,induce synthesis of HbF.This project intends to use DNA methylation chip,RT-PCR,Western blot technologies to test the level on DNA methylation, DNA methyltransferase, as well as the key factors during γ globin regulation before and after treatment,and to explore the possible mechanism of Yisuishengxue granule to treat βthalassemia and reveal the connotation of “Kidney born marrow,marrow generate blood” from epigenetic regulation.

中药治疗β地贫有近30年积累，前期研究发现益髓生血颗粒能够促进γ珠蛋白表达，提高患者胎儿血红蛋白含量。已有研究证实γ珠蛋白基因在胎儿时期表达，出生后γ珠蛋白基因关闭，β珠蛋白基因开始表达并替代γ珠蛋白，这一转化过程与参与γ珠蛋白表达的调控区域CpG上的DNA甲基化状态密切相关；即低甲基化促进γ珠蛋白基因表达，高甲基化抑制γ珠蛋白表达。据此提出中药治疗β地贫可能机制之一是通过调控DNA甲基化水平进而促进γ珠蛋白表达，诱导HbF合成发挥疗效。本项目拟借助DNA甲基化芯片、RT-PCR、Western blot等技术通过对治疗前后患者的全基因组DNA甲基化差异水平、参与γ珠蛋白合成的特异调控区域CpG上的DNA甲基化差异水平、DNA甲基转移酶、以及调控γ珠蛋白转录的关键因子的水平进行检测，验证假说的客观性，研究将从DNA甲基化修饰角度揭示基于“肾生髓、髓生血”治疗地贫的分子机制和理论内涵。

1.项目的背景：γ珠蛋白基因在胎儿时期表达，出生后γ珠蛋白基因关闭。这一转化过程与参与γ珠蛋白表达的调控区域CpG上的DNA甲基化状态密切相关。据此提出益髓生血颗粒治疗β地贫可能机制是通过调控DNA甲基化水平进而促进γ珠蛋白表达发挥疗效。项目采用TAPS、RT-PCR、Western blot等检测技术对患者全基因组DNA甲基化水平、DNA甲基转移酶、调控γ珠蛋白转录因子以及抗氧化损伤因子进行检测。从DNA甲基化修饰角度探讨疗效的分子机制。.2.主要研究内容：以中间型β地贫患者为研究对象，采用益髓生血颗粒治疗3个月，检测患者治疗前后12个样本以及健康对照6个样本共18个样本的全基因组DNA甲基化位点与差异区域；分析对参与调控γ珠蛋白的3个重要调控区域β-globin loci、HBS1L-MYB loci、BCL11A loci的DNA甲基化差异，对DNA甲基转移酶DNMT1/DNMT2/DNMT3、γ珠蛋白（Aγ、Gγ）、BCL11A 的基因与蛋白进行检测，同时对患者治疗前后血浆中S0D、MDA、GSH-PX抗氧化指标进行检测分析。.3.重要结果关键数据及其科学意义:对18个样本全基因组DNA甲基化检测分析，发现患者治疗前后mCpG、mCHG、mCHH3种形式的DNA甲基化水平无差异。研究采用metilene软件进行全基因组差异甲基化区域分析，设置可信度筛选条件：DMR内CpG位点的覆盖深度>10；DMR内CpG位点个数大于>10；差异显著性q-value值<0.05进行分析后发现对比患者治疗前后，β-globin loci调控区域、HBS1L-MYB loci调控区域、BCL11A loci调控区域均不存在差异甲基化区域。益髓生血颗粒能够提高6例地贫患者Hemoglobin gamma G蛋白表达，表明药物提高Hemoglobin gamma G并非通过调控此三个区域的DNA甲基化水平。通过分析患者治疗前后全基因组DNA甲基化水平差异基因及位点，发现患者治疗前后ZFP42和MYO16-AS1基因的DNA甲基化水平差异最大。两个基因如何参与益髓生血颗粒治疗地贫过程尚需要深入的研究。检测发现益髓生血颗粒能够提高6例地贫患者血浆SOD和GSH-PX，降低MDA，表明益髓生血颗粒具有提高患者患者抗氧化损伤的能力。