茼蒿抑制西瓜枯萎病菌的物质基础及机理研究

Regarding the cheap and abundant Chrysanthemum coronarium which shows relatively good inhibitory effect on watermelon blight germs as the research subject, we will study antifungal components and antimicrobial mechanisms of watermelon cultivars with different resistances to Fusarium oxysporum f.sp. niveum. By means of bioassay-guided separation with F. oxysporum f.sp. niveum. as indicating strain, the antifungal components from stems of Chrysanthemum coronarium will be isolated by chromatography and identified by UV, IR, MS and NMR, and obtain a preferred separation method based on the molecular polarity characteristic. By the test of inoculating Fusarium oxysporum f.sp. niveum to watermelon plants, we can get the antifungal efficacy and the optimum ratio. To explore antimicrobial mechanisms, we are conducting systematic research on ultra structure, membrane permeability, substance and energy conversion, subcellular localization, interaction site and mechanism with the substance which has strong antifungal bioactivity by electron microscopic observation, the confocal laser scanning microscopic observation, fluorescent labeling, biochemical reactions and the method of molecular biology. The project which will apply the dependable theory and experiment base on the research of screening other natural antifungal components, antifungal mechanism and the development of botanical natural germicides, is highly valuable for academic study and application.

本项目拟以具有较好抑制西瓜枯萎病菌效果且资源廉价丰富的茼蒿为对象，研究其抑制西瓜枯萎病的物质基础及抑菌机理。以西瓜生长期的枯萎病菌（西瓜尖镰孢菌）为生物活性导向分离指示菌株，采用硅胶、葡聚糖凝胶、制备色谱等现代分离技术，从茼蒿中分离纯化出抑菌功效成分，并鉴定其结构。在此基础上，根据活性物质的分子极性特征获得优选分离方法。通过对接种西瓜尖镰孢菌的西瓜植株进行栽培试验验证活性成分的抑菌效果及功效组分的最佳配比。通过电镜观察、激光共聚焦显微镜观察、荧光标记、生化试验及分子生物学的方法，对抑菌活性物质作用后的菌体超微形态、细胞膜透性、能量及物质代谢、细胞内的定位、作用位点及机制进行系统研究，探索其抑菌机理。本项目可以为其他天然抑菌活性成分的筛选及抑菌机理研究提供可行的实验方法和理论依据，为研究和开发天然植物源杀菌剂奠定理论基础，为茼蒿的深度开发和利用提供科学依据，具有重要的学术价值和应用前景。

本项目以具有较好抑制西瓜枯萎病菌效果且资源廉价丰富的茼蒿为对象，研究了其抑制西瓜枯萎病菌的物质基础及抑菌机理。以西瓜生长期的枯萎病菌（西瓜尖镰孢菌）为生物活性导向分离指示菌株，采用硅胶、葡聚糖凝胶、制备色谱等现代分离技术，从茼蒿中分离纯化出了抑菌功效成分，并鉴定其结构。在此基础上，通过电镜观察、生化试验的方法，对抑菌活性物质作用后的菌体超微形态、细胞膜透性、物质代谢进行系统研究，探索其抑菌机理。结果如下：（1）茼蒿茎叶、 根、根际区土壤3个部位的水浸提液对西瓜枯萎病菌的生长均有一定的抑制作用，在100 mg•mL-1的浓度下抑制率分别为53%、49%、45%。经室内毒力测定，3个部位的EC50分别为86.26、84.65、106.88 mg•mL-1。（2）通过单因素试验和响应面优化分析法研究了乙醇浓度、提取温度、料液比和提取时间对提取茼蒿抑菌物质的影响，并优化了提取工艺参数｡固定乙醇浓度为95%, 各自变量对茼蒿抑菌物质提取率的主次关系由大到小依次为: X3 (温度) 、X2 (料液比) 、X1 (提取时间)。超声波提取的响应面最佳优化工艺为: 提取时间103 min，液料比26 mL•g-1。（3）经不同浓度茼蒿粗提液灌根处理后，西瓜幼苗叶片活性氧代谢指标(SOD、POD、CAT等酶的活性)，防御酶体系指标(PPO、PAL、几丁质酶活性)，细胞膜透性指标(可溶性蛋白、H2O2含量)较对照都有所增加，而MDA含量较对照降低。（4）分离纯化出抑菌活性成分并对其结构进行了鉴定, 茼蒿中抑制西瓜枯萎病菌的主要活性成分为绿原酸；对活性成分的抑菌效果进行了验证，绿原酸对西瓜枯萎病菌的 MIC和MFC分别为31.25、125mg•ml-1，经室内毒力测定，其对西瓜枯萎病菌的EC50为50.038 mg•ml-1｡（5）绿原酸能够抑制西瓜尖镰孢菌孢子萌发､ 菌丝生长，增大细胞膜渗透性，降低SDH和MDH的活性。通过对绿原酸作用后的菌丝体和细胞的超微结构观察发现，西瓜尖镰孢菌的菌丝体和细胞呈现出不同程度受损情况，主要表现为菌丝体破败、菌丝体细胞出现质壁分离和细胞器解体等现象｡