大环寡肽新亚家族Viba14与植物重金属耐性的关系

大环寡肽（cyclotides）是少数科属植物基因编码的环肽，在植物抗生物胁迫中具有重要作用，而在植物防卫非生物胁迫（重金属）中的作用尚需更多实验证据的解析。本项目将以堇菜属植物中发现的大环寡肽新亚家族Viba14前体基因为研究对象，采用分子生物学技术、生物信息学技术及转基因技术研究它们在源植物中的表达调控模式、环肽结构以及在工程菌和拟南芥中的异源重组表达与重金属胁迫抗性的关系，明确Viba14亚家族环肽在植物抗重金属胁迫中的作用，以期揭示大环寡肽在重金属胁迫下的表达是否是植物重金属耐性/富集的新机制及确定大环寡肽新的生理功能，为以后利用转基因技术促进植物重金属耐性改良用于重金属污染土壤的治理和农业生产，提供新的基因资源。

堇菜属植物广泛分布着金属型植物，包括重金属超富集植物宝山堇菜；植物大环肽（Cyclotides）是一类基因编码的具有三对二硫键的首尾环化多肽，它们在堇菜属植物中的分布尤其丰富和典型。本项目工作在以下几个方面取得进展。（1）成功获取5种代表性堇菜属植物的组织培养幼苗，并通过土壤试验发现土壤Cd、Pb和P影响乡土丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi, AM）在宝山堇菜之间的定植，反之AM也能调控植物对Cd、Pb和P的吸收；（2）应用自主开发的环肽基因通用引物PCR扩增，限制片段长度cDNA文库筛选技术，转录组测序技术从堇菜属植物中筛选环肽近300个；（3）基于环肽的一级结构，以及在前体蛋白中的分布特征，应用Perl语言开发出一种在基因组和海量蛋白序列中，高通量筛选环肽工具CyPerl，从植物基因组和蛋白数据库中筛选出500多个环肽及其类似物；（4）基于宝山堇菜基因组测序的前期结果，分析出宝山堇菜中基因组编码近200种环肽；（5）基于内含肽融合表达技术，构建10个大环肽Viba14亚家族序列的重组表达质粒，建立了它们的大肠杆菌重组表达与体外纯化工艺，对获得的终产物进行分子鉴定和重金属相关功能研究，结果发现这些大环肽有一定拮抗重金属的潜力以及细胞毒性和抑菌能力。本项目工作表明，环肽和重金属在植物体的同时存在的生态学意义可能是：进一步提升植物对生物胁迫的防卫能力。项目工作发表了3篇SCI论文，影响因子均大于2，其中1篇影响因子大于3。在人才培养方面，本项目培养研究生6名，本科毕业生20名。