EETs介导的GABA抑制在脑卒中后中枢痛丘脑敏化中的作用机制及干预研究

Central sensitization in thalamus accounts for the major pathophysiology of central poststroke pain (CPSP), the mechanism of which remains unclear. Stroke in the thalamus could disinhibit the activity of thalamic ventral posterolateral (VPL) and reticular nucleus that contain GABA-ergic inhibitory interneurons and then cause thalamic sensitization. Given that EETs could stimulate neurosteroids production by multiple pathways, and moreover, neurosteroids could potentiate inhibitory GABA currents in neurons, we set our experiment. We plan to do the rat thalamic slice culture and establish rat CPSP model to detect the following neurosteroids production and thalamic neuronal activity. After that we will use 14,15-EET, sEHI and EEZE to elevate and inhibit EETs activity respectively, and then observe their effects on thalamic GABA-ergic interneurons survival and its inhibitory role on ascending pain transmission, and the subsequent thalamic sensitization as well. The effects are evaluated by multiple aspects, such as electrophysiology, morphology, molecular biology and behavioral test. Our research is the first to explore the EETs involvement on thalamic sensitization via GABA-ergic inhibition, which could probably provide a new clinic therapeutic target for alleviating central neuropathic pain based on its intrinsic mechanism.

丘脑中枢敏化是脑卒中后中枢痛产生的基础，机制复杂。丘脑腹后外侧核和网状核GABA能中间神经元的去抑制在丘脑中枢敏化中起重要作用。研究发现环氧二十碳三烯酸（EETs）可促进中枢神经系统神经甾体合成，而神经甾体与GABA能介导的抑制性通路有密切联系。本课题拟培养离体丘脑脑片和建立大鼠脑卒中后中枢痛模型，观察丘脑神经甾体合成及丘脑神经兴奋性的变化情况。通过应用14,15-EET、sEHI和EEZE分别上调与下调EET活性，从电生理学、 形态学、分子水平、行为学等方面观察调节EETs活性对维持GABA能中间神经元存活及上行抑制功能的影响及机制，评价其在丘脑中枢敏化形成中的作用。本课题从GABA抑制的角度，首次探究EETs在丘脑敏化中的作用，为探讨一种基于中枢性神经病理性疼痛发病机制的治疗途径提供科学依据。

脑卒中后中枢痛（Central post-stroke pain, CPSP）是中枢神经病理性疼痛最常见的类型，主要表现为自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏。脑卒中后中枢痛发病机制复杂，对目前临床一线药物治疗反应较差。最近研究表明EETs对脑卒中缺血缺氧性损伤具有众多的神经保护作用，EETs及sEH抑制剂在炎性疼痛、痛性糖尿病神经病变等神经病理性疼痛中均能发挥镇痛作用，但EETs及sEH抑制剂在脑卒中后中枢痛中的作用及机制目前尚未完全明确。本研究采用于丘脑腹后外侧核（VPL）内立体定位注射0.025U IV型胶原酶构建CPSP大鼠模型，运用高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS）检测大鼠丘脑内14,15-EET的含量变化，酶联免疫吸附法（ELISA）检测丘脑四氢孕酮（AP）的浓度，免疫荧光及western blot法测定类固醇急性急性调节蛋白(StAR)，含δ-亚基的γ-氨基丁酸A受体（δGABAAR）的含量变化，并于建模后连续3d给予vehicle（1%DMSO）、不同浓度的14,15-EET以及14,15-EEZE（3.25ng）分别处理CPSP大鼠，不同时间段采用von Frey法测定大鼠足底的PWMT，检测StAR和δGABAAR蛋白的表达以及AP的浓度。此外，我们还通过免疫荧光观察星形胶质细胞和小胶质细胞激活、ELASA检测促炎症因子和抗炎细胞因子的表达，WB检测凋亡相关蛋白表达情况来探讨14-15EE缓解CPSP的其他可能机制。我们研究发现丘脑出血性卒中可导致机械性痛觉超敏反应，而且14,15-EET的含量及AP的浓度降低，内侧丘脑δGABAAR表达下调可能是CPSP痛觉超敏反应的主要机制。14,15-EET通过上调StAR蛋白的表达，促进AP的合成，同时增加VPL区δGABAAR的表达，可缓解脑卒中后中枢痛。同时，14,15-EET还可以通过抑制炎症细胞激活，降低促炎细胞因子表达，下调凋亡相关蛋白等多种机制发挥镇痛作用，可以为脑卒中后中枢痛病人痛觉过敏提供有效的治疗思路，有较好的临床应用价值。我们的研究明确了调控丘脑EETs活性，可以保护神经元卒中后损伤，维持GABA能中间神经元的上行抑制功能，从而抑制丘脑中枢敏化的形成，为脑卒中后中枢痛的防治提供切实有效的实验理论依据。