基于核酸适体的生物条形码技术对大豆过敏蛋白的超灵敏分析

大豆中的过敏蛋白是大豆中对热稳定的抗营养因子，能引起人和动物不同程度的过敏。但由于其分子量大，难纯化，不易制备单抗等因素，目前尚不能准确定量检测，导致过敏蛋白的深入研究受阻和生产中大豆制品的质量难以判断。核酸适体是一类通过指数富集配体系统进化筛选出的与目标蛋白特异性结合的DNA片段，具有高度的特异性；纳米金具有优异的光电特性和生物相容性，可提高检测灵敏度和稳定性；本课题在两者优势相结合的基础上提出了新的分析技术，即采用"核酸适体-纳米粒子"为生物条形码，利用酶联核酸（ELAA）模型，实现"蛋白/核酸适体-纳米粒子"在酶标板上的组装，利用酶催化底物显色法实现大豆及其大豆制品中的Gly m Ed 60K、 Gly m Bd 30K、 和Gly m Ed 28K 三种主要过敏蛋白的高选择、灵敏、准确定量分析，从而促进蛋白过敏机制的深入研究并推动大豆加工工艺的发展。

大豆因其蛋白质含量高和氨基酸平衡性好而成为人和动物优秀的植物性蛋白质源。然而，大豆中含有一些过敏蛋白，这些蛋白能引起仔猪、犊牛等幼龄动物，特别是断奶仔猪的过敏反应，甚至导致仔猪的死亡。但由于这些分子量大，纯品不易获得，一直很难准确定量，给养猪生产带来了严重的影响。本项目在前期工作的基础上，制备了主要大豆过敏蛋白的纯品，筛选了针对这些蛋白的特异性抗体或DNA序列，建立了检测主要大豆过敏蛋白的ELISA检测方法，并用于大量实际样品的检测。解决了实际生产中大豆过敏蛋白定量难的技术问题。.主要研究成果如下：.1. 大豆过敏蛋白标准品的制备。根据拟定的预期目标，本课题组成员密切合作，通过原核表达或天然蛋白纯化等方式完成了过敏蛋白Gly m Ed 60K, Gly m Bd 30K, 和Gly m Ed 28K的高纯度表达和纯化工作，获得了这些蛋白的高纯度表达品，Gly m Ed 60K, Gly m Bd 30K, 和Gly m Ed 28K纯度分别达90%，80%，和95%。.2、通过动物免疫或体外SELEX筛选获得了针对这些蛋白的高特异性的抗体或核酸适配体。建立了基于双抗夹心或竞争ELISA法的对Gly m Ed 60K、β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素等大豆中主要过敏蛋白的高灵敏度检测方法，大豆样品的添加回收结果表明，方法的灵敏度为在0.45-10 ng/mL之间，平均回收率在88.1%-106.6%之间，批间和批内变异系数均小于15%，方法能满足大豆及其加工产品中大豆过敏蛋白的定量测定。.3. 实际样品的测定：用上面建立免疫学检测方法完成了近1000个多个世界主要大豆核心种质的β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子和凝集素共4种主要大豆过敏蛋白的测定，并比较了250多个不同产地、不同年代和5种不同加工工艺大豆产品中4种主要大豆过敏蛋白的含量。建立了系统的大豆抗原蛋白数据库，为大豆品种的选育及不同加工工艺的大豆产品在畜禽饲料中的高效利用提供了基本参数。.本课题达到了预定的研究目标，已发表SCI收录论文1篇（IF 4.75）、中文核心期刊1篇，课题负责人均为通讯作者。培养了2名研究生，其中1名硕士研究生已经毕业（毕业论文封面见附件），毕业论文获2012年度中国农业大学10篇优秀硕士论文。本项目的研究经费基本按照预算方案进行使用。