基于核酸适体的超高灵敏度化学发光蛋白质分析新技术的研究

蛋白质的超高灵敏度检测在生命科学、临床疾病诊断及蛋白多肽类药物分析领域有重要的意义。核酸适体能够特异性地识别目标分子，是一种新型的蛋白质识别手段。化学发光测定金离子灵敏度高，且一个金纳米微粒中包含有成千上万的金原子，以金纳米微粒为标记，反应结束后将金纳米微粒溶解释放出大量的金离子，催化鲁米诺产生化学发光，能实现目标分子的高灵敏度检测。课题以血小板源细胞衍生化生长因子（PDGF）-BB为例，金纳米微粒为标记，将羟胺还原与aptamer-barcode、循环累积、滚环复制和聚合酶链反应相结合，构建多种二次放大技术，发展超高灵敏度的基于核酸适体的化学发光蛋白质分析新技术，以实现PDGF-BB的超高灵敏度检测。该方法能很容易拓宽至其他许多目标分子的分析，具有广泛的用途。除此之外，课题拟构建基于发夹结构的核酸适体化学发光蛋白分析技术。该方法的成功构建，能为发展基于适体的胶体金蛋白检测试纸条奠定基础。

课题致力于以核酸适体为识别分子，金纳米微粒为标记物发展高灵敏度的化学发光蛋白质检测新技术。首先，以磁性微球为载体，PDGF-BB为模型目标蛋白，建立了PDGF-BB的化学发光检测方法，结果不理想。根据研究计划，进一步以96 孔微孔板为载体，采用羟胺还原反应进行放大检测，测定目标分析物PDGF-BB的灵敏度达到了60 pM。同时，利用所发展的羟胺还原染色法，实现了人凝血酶的超高灵敏度检测，其检测限达到了3.2 fM。第二，建立了多种二次放大技术，以提高目标蛋白分析物的检测灵敏度。首先是采用聚苯乙烯微球放大，但结果不理想。之后，构建了滚环复制放大体系，使PDGF-BB的检测限达到了2 pM。除此之外，在研究滚环复制放大的实验过程中，发现T4 DNA连接酶的活性与ATP浓度密切相关。基于此，以金纳米微粒为标记，结合羟胺还原放大，实现了高灵敏度、高选择性化学发光法检测ATP。第三，课题组利用发夹形核酸适体与目标分析物结合前后构型改变引起的空间位阻变化，以金纳米微粒为标记物，实现了乳癌基因的检测。研究发现核酸适体与目标分析物结合后，与氧化石墨烯的结合能力会减弱。以此为基础，构建了无标记的化学发光法检测ATP。课题组在开展课题的同时，也积极研究新型的化学发光生物分析的标记物，以氧化石墨烯为标记物，建立了超高灵敏度的人IgG的新型化学发光免疫分析方法。课题组同时发现磁性微球具有淬灭某些luminol化学发光反应的能力，基于此构建了无标记的胰蛋白酶分析方法。综上，本项目通过三年的研究工作，已基本完成项目计划内容，合计已发表SCI论文7篇，其中在Biosensors & Bioelectronics（IF=6.451）和Analyst（IF=3.906）上各发表2篇，在Analytical Chemistry （IF=5.825），Talanta （IF=3.511）和Analytical Methods（IF=1.938）上各发表1篇，影响因子合计为31.988，截止至2015年1月，他引合计31次。 基于本研究项目，现已培养硕士研究生6名，3名已毕业，3名在读。